本发明专利技术公开了一个用于识别Gremlin‑1的核酸适配子及其应用，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质Gremlin‑1的核酸适配子。结果表明，所筛选的核酸适配子可以特异性识别并结合蛋白质Gremlin‑1，且具有较高的特异性及灵敏性。经过生物素标记后的核酸适配子可以应用于核酸蛋白质印迹(South‑Western blotting)、基于适配子的酶联吸附试验(ELAA)、细胞及组织化学染色(Aptamer‑based histochemistry and cytochemistry)。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，有望被开发成为体内外检测蛋白质Gremlin‑1的有力工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质检测
，具体涉及一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子及其应用。
技术介绍
Gremlin-1是一种高度保守的，含184个氨基酸，可糖基化和磷酸化的分泌型蛋白质。Gremlin-1可与骨形态形成蛋白(Bonemorphogenetieprotein，BMP)2、BMP4、BMP7，血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)，YWHAH和Slit蛋白结合，影响其生物学作用。Gremlin-1在胚胎发育、肢体形成、肾脏、肺脏等器官的发育过程中起着非常重要的作用。在个体发育完善后其表达逐渐减少，但是在有些病理过程如糖尿病肾病、特发性肺纤维化、青光眼等疾病中都能发现Gremlin-1表达的增高，且被证实Gremlin-1在这些疾病中有明显的促纤维化作用。同时，Gremlin-1与很多恶性肿瘤的发生都有关系，如宫颈癌，肺癌等。SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体(Aptamer)。它的基本思想是：体外化学合成一个单链寡核苷酸库，由于每个不同序列的单链核酸可以自身折叠形成特异的二级结构，不同二级结构的单链核酸就有可能与不同靶分子或一个靶分子中的不同位点依照热力学原理结合，从而筛选出与靶分子结合的短链核酸即特异的适配子。核酸适配子能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此在生物传感器研究、疾病诊断、治疗等方向有广阔的应用前景。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，并且具有抗体所不具备的其他一些优点，如筛选周期短，能应用于大规模的工业生产；生产成本低，稳定性好，重复性强，生产中很少存在批次间的差异；没有免疫原性，没有毒性和明显的副作用；易于化学修饰，可以在合成时精确、定点连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶或金属微粒等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子及其应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开了一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子，该核酸适配子命名为G-ap49，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。在所述核酸适配子G-ap49的核苷酸的5′端带有生物素标签。所述核酸适配子G-ap49不带固定序列的结构为：所述核酸适配子G-ap49能特异性识别Gremlin-1全长。本专利技术还公开了上述核酸适配子在制备识别Gremlin-1的检测试剂中的应用。本专利技术还公开了上述核酸适配子在制备识别Gremlin-1的检测试剂盒中的应用。本专利技术还公开了含有上述核酸适配子的检测试剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术公开了一种识别蛋白质Gremlin-1的核酸适配子序列，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质Gremlin-1全长的核酸适配子。经过生物素标记后的核酸适配子可以应用于核酸蛋白质印迹(South-Westernblotting)、基于适配子的酶联吸附试验(ELAA)、细胞及组织化学染色(Aptamer-basedhistochemistryandcytochemistry)。结果表明，大量制备的核酸适配子G-ap49可以特异性识别Gremlin-1。因此，G-ap49有望被开发为Gremlin-1的体外检测试剂盒，且可能具有较高的特异性及灵敏性。附图说明图1为筛选的核酸适配子G-ap49与重组人Gremlin-1亲和力结果；图2为不带固定序列的G-ap49预测的二级结构图；图3为G-ap49与重组人Gremlin-1特异性结合的Dot-blot印迹图；图4为G-ap49结合重组人Gremlin-1的解离常数分析图；图5为G-ap49分别与重组人Gremlin-1和小鼠纤维化肺组织所做的South-Westrenblot图；其中，(a)为G-ap49与重组人Gremlin-1；(b)为G-ap49与小鼠纤维化肺组织；图6为G-ap49稳定性实验结果；图7-1，图7-2分别为改变G-ap49浓度，改变重组人Gremlin-1浓度所做的基于适配子的酶联免疫吸附试验；图8为G-ap49用小鼠纤维化肝组织切片所做的组织化学染色；其中，A为normalrabbitIgG；B为anti-Gremlin-1Ab；C为ssDNAlibrary；D为G-ap49；图9为G-ap49用转染了重组质粒PEGFP-C2-hGremlin-1或PEGFP-C2的HEK293细胞爬片所做的细胞化学染色。具体实施方式本专利技术通过SELEX技术，成功筛选了识别重组人Gremlin-1的核酸适配子。人工合成的随机单链DNA文库通过SELEX方法筛选出与重组人Gremlin-1特异性结合的单链DNA，经测序获得该单链DNA序列后，通过人工合成大量制备，并进行生物素标记。结果表明带有生物素标签的核酸适配子可以特异性的识别重组人Gremlin-1，可以应用于核酸蛋白质印迹(South-Westernblotting)、基于适配子的酶联吸附试验(ELAA)、细胞及组织化学染色(Aptamer-basedhistochemistryandcytochemistry)。下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。一、SELEX技术筛选核酸适配子1、随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成1)构建并人工合成长度为76个碱基(nt)的随机ssDNA文库，两端为18个碱基的固定序列，中间为40个碱基的随机序列，文库容量大约为1015～1016(Takara公司，大连，中国)。5′–GGACAAGAATCACCGCTC–N40–CGTACAGGAGGCATACAG–3′2)合成引物：上游引物：5′–GGACAAGAATCACCGCTC–3′下游引物：5′–CTGTATGCCTCCTGTACG–3′2、微孔板为介质的SELEX筛选1)微孔板包被方法：将重组人Gremlin-1(R&D生物科技有限公司,明尼阿波里斯市,美国)按50ng/孔溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)，100μl/孔包被于Nunc96孔酶联板上，4℃过夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK缓冲液配制：20mMHepes，120mMNaCl，5mMKCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2，pH7.4)封闭，37℃2小时，备用，同时包被不加重组人Gremlin-1，只用3％BSA封闭的微孔，备用。2)SELEX筛选方法：a)取200ng文库ssDNA溶于100μlSHMCK缓冲液。将ssDNA95℃热变性10分钟，立即冰浴10分钟，室温下放置10分钟。复性的ssDNA溶液中加入酵母tRNA(终浓度100μg/ml)及BSA(1mg/ml)。酵母tRNA及BSA用于去除文库中与其结合的ssDNA。b)将以上混合溶液先加入BSA包被的微孔内，37℃孵育1小时，反筛去除与BSA结合的ssDNA。然后，将孔内液体转移至重组人Gremlin-1包被孔，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于识别Gremlin‑1的核酸适配子，其特征在于，该核酸适配子命名为G‑ap49，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子，其特征在于，该核酸适配子命名为G-ap49，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.如权利要求1所述的用于识别Gremlin-1的核酸适配子，其特征在于，在所述核酸适配子G-ap49的核苷酸的5′端带有生物素标签。3.如权利要求1所述的用于识别Gremlin-1的核酸适配子，其特征在于，所述核酸适配子G-ap...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝志明，李倩，郑晓燕，李爽，孙文刚，李汉超，
申请(专利权)人：西安交通大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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