新型AAV8突变衣壳和含有其的组合物制造技术

本文提供AAV8突变衣壳和包含所述AAV8突变衣壳的rAAV。在一个实施方案中，采用所述AAV8突变衣壳的载体显示相较于AAV8，在所选组织中的转导增加。

New AAV8 Mutant Capsid and Compounds Containing it

The mutant capsid of AAV8 and rAAV containing the mutant capsid of AAV8 are provided in this paper. In one implementation, carrier display using the mutant capsid of AAV8 increases transduction in selected tissues compared with AAV8.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型AAV8突变衣壳和含有其的组合物以电子形式提交的材料的引用并入申请人据此以引用的方式将以电子形式随本文一起提交的序列表材料并入。这个文件标记为“UPN-16-7726PCT_ST25.txt”。专利技术背景腺相关病毒(AAV)在人基因疗法中具有极大前景，并且由于它能够提供长期基因表达以及缺乏病原性而已被广泛用于在各种研究中靶向肝、肌肉、心脏、脑、眼、肾和其它组织。AAV属于细小病毒科，并且各自含有由两个反向末端重复序列侧接的单链DNA。已报道几十种天然存在的AAV衣壳，它们的独特衣壳结构使得它们能够识别和转导不同细胞类型和器官。自从始于1981年的首个试验以来，在基于腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法的临床试验中，尚未报道任何载体相关毒性。AAV载体在临床试验中不断积累的安全性记录联合经证明的功效显示AAV是用以共同操作的良好平台。另一具有吸引力的特征是AAV相对易于操作，因为AAV是具有小型基因组(约4.7kb)和简单遗传组分–反向末端重复序列(ITR)、Rep和Cap基因的单链DNA病毒。在AAV载体中仅需要ITR和AAV衣壳蛋白，其中ITR充当用于载体产生的复制和包装信号，而衣壳蛋白通过形成衣壳以容纳载体基因组DNA，决定组织向性，以及将载体基因组DNA递送至靶标细胞中来起主要作用。已主要存在四种方式来获得AAV衣壳基因：从培养物或组织样品分离AAV，AAV定向进化，改组以及合理设计。已显示AAV8会有效转导肝、肌肉。此外，在患有重度B型血友病的患者中，通过单次外周静脉输注达成的经AAV8介导的hFIX基因转移始终导致FIX转基因以治疗水平长期表达，而无急性或持久毒性。AAV载体在基因转移中具有许多优势，但仍然有一些问题待解决。因此，需要更有效的AAV载体。
技术实现思路
在一个方面，提供一种腺相关病毒。病毒包含AAV8突变衣壳。在一个实施方案中，衣壳具有序列SEQIDNO:18，并且被称为AAV3G1。在另一实施方案中，衣壳具有序列SEQIDNO:20，并且被称为AAV8.T20。在另一实施方案中，衣壳具有序列SEQIDNO:22，并且被称为AAV8.TR1。在另一方面，提供一种编码如本文所述的衣壳的核酸。在一个实施方案中，衣壳由SEQIDNO:17或与其共有至少95％同一性的序列编码。在另一实施方案中，衣壳由SEQIDNO:19或与其共有至少95％同一性的序列编码。在另一实施方案中，衣壳由SEQIDNO:21或与其共有至少95％同一性的序列编码。在另一实施方案中，包括AAV8突变衣壳的AAV至少包括vp3衣壳，其相较于天然AAV8(SEQIDNO:34)在以下区域中的至少一个中具有突变：i.氨基酸263至267(SEQIDNO:78)；ii.氨基酸457至氨基酸459；iii.氨基酸455至氨基酸459(SEQIDNO:81)；或iv.氨基酸583至氨基酸597(SEQIDNO:69)。在一个实施方案中，相较于AAV8，具有AAV8突变衣壳的AAV在靶标组织中具有增加的转导。在一个实施方案中，靶标组织是肌肉、肝、肺、气道上皮、神经元、眼或心脏。在另一实施方案中，相较于天然AAV8，具有AAV8突变衣壳的AAV具有增加的逃脱AAV中和抗体的能力。在一个实施方案中，vp1和/或vp2独特区域源于与提供vp3独特区域的AAV(即AAV8)不同的AAV。在一个实施方案中，提供vp1和vp2序列的AAV是rh.20。在一个实施方案中，rh.20vp1序列是SEQIDNO:88。在另一实施方案中，AAV进一步包括AAV反向末端重复序列和异源性核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至指导由所述异源性核酸序列编码的产物在靶标细胞中表达的调控序列。在另一方面，提供一种转导靶标组织的方法。在一个实施方案中，方法包括施用具有如本文所述的衣壳的AAV。在一个实施方案中，提供一种转导肝组织的方法，其包括施用具有AAV3G1衣壳的AAV。在另一实施方案中，提供一种转导肌肉组织的方法，其包括施用具有AAV3G1衣壳的AAV。在另一实施方案中，提供一种转导气道上皮的方法，其包括施用具有AAV3G1或AAV8.T20衣壳的AAV。在另一实施方案中，提供一种转导肝组织的方法，其包括施用具有AAV8.TR1衣壳的AAV。在另一实施方案中，提供一种转导眼部细胞的方法，其包括施用具有AAV3G1衣壳的AAV。在另一方面，提供一种产生相较于野生型衣壳，具有增加的靶标组织转导的突变AAV衣壳的方法。方法包括在针对野生型衣壳的中和抗体的接触区处进行诱变；以及在单克隆抗体存在下进行体外选择。在一个实施方案中，方法包括在衣壳的高变区处进行额外突变。在另一实施方案中，方法进一步包括用来自不同AAV衣壳的vp1和/或vp2序列取代vp1和/或vp2独特序列。在另一方面，提供一种产生包含AAV衣壳的重组腺相关病毒(AAV)的方法。在一个实施方案中，方法包括培养含有以下各物的宿主细胞：(a)编码AAV衣壳蛋白的分子，相较于天然AAV8(SEQIDNO:34)，衣壳在以下区域中的至少一个中具有突变：i.氨基酸263至267(SEQIDNO:78)；ii.氨基酸457至氨基酸459；iii.氨基酸455至氨基酸459(SEQIDNO:81)；或iv.氨基酸583至氨基酸597(SEQIDNO:69)；(b)功能性rep基因；(c)包含AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因的小基因；和(d)足以容许所述小基因包装至所述AAV衣壳蛋白中的辅助功能物。在另一方面，提供一种重组腺相关病毒(AAV)。在一个实施方案中，rAAV包括具有选自以下的氨基酸序列的AAV衣壳：SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32。所述衣壳有时在本文中称为“AAV8突变衣壳”。rAAV进一步包括非AAV核酸序列。在另一方面，提供一种编码AAV衣壳序列的核酸分子。在一个实施方案中，核酸序列选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31。在另一方面，提供一种AAV衣壳蛋白。相较于天然AAV8(SEQIDNO:34)，AAV衣壳在以下区域中的至少一个中具有突变：i.氨基酸263至267(SEQIDNO:78)；ii.氨基酸457至氨基酸459；iii.氨基酸455至氨基酸459(SEQIDNO:81)；或iv.氨基酸583至氨基酸597(SEQIDNO:69)。在另一方面，提供一种编码如本文所述的AAV衣壳的核酸序列。在另一方面，提供一种用如本文所述的腺相关病毒转染的宿主细胞。在另一方面，提供一种组合物，其至少包含如本文所述的AAV以及生理上可相容的载剂、缓冲剂、佐剂和/或稀释剂。在另一方面，提供一种将转基因递送至细胞中的方法。方法包括使细胞与如本文所述的AAV接触的步骤，其中所述rAAV包含转基因。附图说明图1A提供用于AAV突变体文库构建的质粒的图谱。图1B说明AAV突变体文库构建的选择过程。图2A是说明在抗体-衣壳接触位点处的诱变赋予体外Nab抗性的条形图。HEK293细胞由携带CMV.eGFP、与培养基(无Ab)、抗体ADK8、ADK8/9或ADK9混合的AAV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺相关病毒，其包含具有序列SEQ ID NO:18(AAV3G1)、SEQ ID NO:20(AAV8.T20)或SEQ ID NO:22(AAV8.TR1)的衣壳。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.15 US 62/3233891.一种腺相关病毒，其包含具有序列SEQIDNO:18(AAV3G1)、SEQIDNO:20(AAV8.T20)或SEQIDNO:22(AAV8.TR1)的衣壳。2.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的衣壳。3.根据权利要求1所述的AAV，其中所述衣壳由SEQIDNO:17、SEQIDNO:19或SEQIDNO:21或与其共有至少80％同一性的序列编码。4.一种至少包含vp3衣壳的腺相关病毒，所述vp3衣壳相较于天然AAV8(SEQIDNO:34)在以下区域中的至少一个中具有突变：i.氨基酸263至267；ii.氨基酸457至氨基酸459；iii.氨基酸455至氨基酸459；或iv.氨基酸583至氨基酸597。5.根据权利要求4所述的AAV，其中靶标组织是肌肉、肝、肺、气道上皮、神经元、眼或心脏。6.根据权利要求4所述的AAV，其中所述突变包括：i.263NGTSG267(SEQIDNO:78)-->SGTH(SEQIDNO:79)；或ii.263NGTSG267(SEQIDNO:78)-->SDTH(SEQIDNO:80)。7.根据权利要求4至6中任一项所述的AAV，其中所述突变包括：i.457TAN459-->SRP；或ii.455GGTAN459(SEQIDNO:81)-->DGSGL。8.根据权利要求4至7中任一项所述的AAV，其中所述突变包括583ADNLQQQNTAPQIGT597(SEQIDNO:69)-->GDNLQLYNTAPGSVF(SEQIDNO:70)。9.根据权利要求4所述的AAV，其中所述vp3蛋白包含以下突变：263NGTSG267(SEQIDNO:78)-->SGTH(SEQIDNO:79)、457TAN459-->SRP、以及583ADNLQQQNTAPQIGT597(SEQIDNO:69)-->GDNLQLYNTAPGSVF(SEQIDNO:70)。10.根据权利要求4所述的AAV，其中所述vp3蛋白包含以下突变：263NGTSG267(SEQIDNO:78)-->SDTH(SEQIDNO:80)、455GGTAN459(SEQIDNO:81)-->DGSGL(SEQIDNO:82)、以及583ADNLQQQNTAPQIGT597(SEQIDNO:69)-->GDNLQLYNTAPGSVF(SEQIDNO:70)。11.根据权利要求4至10中任一项所述的AAV，其中所述vp3区域的剩余部分与AAV8(SEQIDNO:34)是相同的。12.根据权利要求4至11中任一项所述的AAV，其中vp1和或vp2独特区域源于与提供所述vp3独特区域的所述AAV不同的AAV。13.根据权利要求12所述的AAV，其中提供所述vp1序列和所述vp2序列的所述AAV是rh.20。14.根据权利要求1至13中任一项所述的AAV，其进一步包含AAV反向末端重复序列和异源性核酸序列，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM威尔逊，Q王，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：美国,US