本发明专利技术涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，以南瓜花叶病毒基因组RNA2所对应的侵染性克隆pSqMV‑RNA2为模板，将增强型绿色荧光蛋白报告基因插入到MP和LCP之间，获得pSqMV‑RNA2‑EGFP重组载体，该载体可与南瓜花叶病毒基因组RNA1所对应的侵染性克隆pSqMV‑RNA1一起通过农杆菌共浸润的方法接种甜瓜，获得能够表达增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒。本发明专利技术为研究该病毒的侵染过程、揭示该病毒的种传机制提供了新的方法和手段，也为其他外源基因的表达或应用多肽的大量获得特供了新的工具。
【技术实现步骤摘要】
一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法
本专利技术涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，属于基因工程领域。
技术介绍
病毒的侵染性克隆是指具有侵染性的cDNA或者通过体外转录获得的具有侵染性的RNA。病毒侵染性克隆的获得使得RNA病毒能够在DNA水平上应用基因工程手段研究病毒各基因功能及病毒致病机制，而侵染性克隆中报告基因的插入和共表达，可以更为直观的观察和记录病毒的侵染过程，推进病毒致病相关研究的进行。目前，绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)就常被用作报告基因。GFP是于1962年在维多利亚多管发光水母中发现的一个发光蛋白，由238个氨基酸组成。而增强型绿色荧光蛋白（EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP）是在野生型GFP的基础上将第64位氨基酸进行突变而成（苯丙氨酸突变成亮氨酸），其发射出的荧光强度比GFP大六倍以上，灵敏度更高。由于GFP发光稳定，且GFP基因的表达没有物种、细胞专一性，在发光过程中不需依赖辅助因子或其他基质而发光，对细胞的光毒性非常弱，它非常适合在病毒学领域中用作活体报告基因，其作用是其它酶类报告蛋白无法比拟的。南瓜花叶病毒(Squashmosaicvirus，SqMV)属于豇豆花叶病毒属的成员，能够侵染甜瓜、南瓜、西瓜、黄瓜等葫芦科作物，可通过机械方法、种子和介体昆虫进行传播。由于该病毒的种传率较高，且该病毒的侵染可以引起植株叶片花叶、皱缩，开花果实期时病害更为严重，对葫芦科作物的种植生产造成了极大的威胁。目前，该病毒侵染性克隆已成功获得，该病毒可以利用反向遗传学手段研究其致病和种传相关机制，推进该病毒病害防控相关工作。另外，该病毒为单链正义RNA病毒，含有RNA1和RNA2两条链，其中，RNA1基因组全长约为5.8Kb，RNA2基因组全长3.3Kb。RNA2基因组全长较短，且编码移动蛋白、大外壳蛋白和小外壳蛋白，在EGFP报告基因的插入和表达方面，该基因组更适合分子操作，在病毒致病和种传相关研究工作中具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，构建了携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，为研究该病毒的侵染过程、揭示该病毒的种传机制提供了新的方法和手段，解决了上述问题。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为CGMCCNo.13940，分类命名为：南瓜花叶病毒，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，详细地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术也提供了一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建方法，包括以下步骤：（1）以侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计含有MP、LCP部分序列的多克隆位点，并进行基因合成，其序列如下：MP-MCS-LCP：5＇GGTAGAACCAAGGCTTATGGTCAAAATGAGTTGGACTTGGCCCAGTTAAGTCTCGACGACACATCAAGCTTGAGAGGTAGCGTCGACCCCGGGGTCGACGGAGCAGGACGTACGAAAGCATACGGACAAAATGAACTAGATCTTGCGCAACTTTCC-3＇，SEQIDNO.1；（2）以（1）、增强型绿色荧光蛋白报告基因（EGFP）和侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计三对引物，其序列如下：S2-1557-F：5＇GGTAGAACCAAGGCTTATGG-3＇，SEQIDNO.2；S2-1557-R：5＇CCATAAGCCTTGGTTCTACC-3＇，SEQIDNO.3；S2-1607-F：5＇CTAGATCTTGCGCAACTTTCC-3＇，SEQIDNO.4；S2-1607-R：5＇GGAAAGTTGCGCAAGATCTAG-3＇，SEQIDNO.5；EGFP-F：5＇GCTTGAGAGGTAGCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAG-3＇，SEQIDNO.6；EGFP-R：5＇GTACGTCCTGCTCCGTCGACCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3＇，SEQIDNO.7；（3）以侵染性克隆pSqMV-RNA2为模板，利用引物S2-1607-F/S2-1557-R进行扩增，获得长度为7990bp的片段，以MP-MCS-LCP为模板，利用引物S2-1557-F/S2-1607-R进行扩增，获得长度为110bp的片段，利用同源重组方式将这两个片段进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得pSqMV-RNA2-MCS；（4）以pCambia3301-EGFP为模板，利用引物EGFP-F/EGFP-R进行扩增，获得长度为757bp的片段，利用同源重组方式将该片段与经SalI单酶切处理的pSqMV-RNA2-MCS进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得pSqMV-RNA2-EGFP，即为保藏号为CGMCCNo.13940的携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体。进一步本专利技术的一种优选方案为：将所述的重组载体pSqMV-RNA2-EGFP采用液氮冻融法导入农杆菌菌株GV3101。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术涉及的南瓜花叶病毒重组载体通过接种可产生携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒，经该病毒侵染的植株在紫外灯下可产生绿色荧光，可以用于观察病毒能否侵染及侵染能力强弱分析，辅助寄主的抗性研究及病毒的弱毒株筛选工作，辅助该病毒防控工作；（2）本专利技术所获得的携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒可用于研究病毒的侵染过程，揭示其种传机制，辅助该病毒致病机制研究；（3）本专利技术所使用的方法可对重组载体中的增强型绿色荧光蛋白报告基因进行替换，用于表达其他外源基因或多肽，为获得大量的目的蛋白特供新的工具。附图说明图1携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建策略；图2接种10天后甜瓜叶片在自然光和紫外灯下所观察到的症状图；图3发病叶片RT-PCR及酶切检测结果。具体实施方式下面将结合附图和实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为CGMCCNo.13940，分类命名为：南瓜花叶病毒，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，详细地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建方法，包括以下步骤：（1）以侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计含有MP、LCP部分序列的多克隆位点（图1），并进行基因合成，其序列如下：MP-MCS-LCP：5＇GGTAGAACCAAGGCTTATGGTCAAAATGAGTTGGACTTGGCCC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为CGMCC No. 13940，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。
【技术特征摘要】
1.一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为CGMCCNo.13940，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。2.一种权利要求1所述的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：（1）以侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计含有MP、LCP部分序列的多克隆位点，并进行基因合成，其序列如下：SEQIDNO.1；（2）以（1）、增强型绿色荧光蛋白报告基因（EGFP）和侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计三对引物，其序列如下：S2-1557-F：SEQIDNO.2；S2-1557-R：SEQIDNO.3；S2-1607-F：SEQIDNO.4；S2-1607-R：SEQIDNO.5；EGFP-F：SEQIDNO.6；EGFP-R：SEQIDNO.7；（3）以侵染性克隆pSqMV-RNA2为模板，利用引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘莉铭，古勤生，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41
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