用于基因治疗应用的犬科动物和猫科动物诱导型表达构建体制造技术

本文提供了包含诱导型基因表达系统的核酸分子、载体和重组AAV。所述系统包括：转基因，其编码与包含启动子的表达控制序列可操作地连接的基因产物；激活结构域，其包含犬科动物或猫科动物反式激活结构域和犬科动物或猫科动物FKBP12

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因治疗应用的犬科动物和猫科动物诱导型表达构建体

技术介绍

[0001]基因治疗的主要挑战是难以调节转基因在体内的表达。几乎基因治疗的所有临床前和临床应用都使用了从组成型启动子表达转基因的载体，这意味着只要载体基因组持续存在，它就在固定水平具有活性。然而，许多适于基因治疗的疾病可能需要调节转基因的表达。已经描述了几种系统，其基于将目的基因置于药物可诱导的工程化转录因子的控制下以便积极地诱导基因表达的一般原理(Clackson等人,1997，《化学生物学新见(Curr Opin Chern BioI)》，1(2):210
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8；Rossi等人,《生物技术当前述评(Curr Opin Biotechnol)》1998.9(5):页码451
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6)。先前已经开发了允许通过施用小分子药物诸如雷帕霉素(rapamycin)或雷帕霉素类似物(rapalog)来诱导转基因表达的系统。
[0002]雷帕霉素类似物调节的基因表达系统描述于例如美国专利号6,015,709；6,117,680；6,133,456；6,150,527；6,187,757；6,306,649；6,479,653和6,649,595。采用技术的两个主要系统包括基于同源二聚化的系统和基于异源二聚化的系统(Rivera等人,1996，《自然医学(Nature Med)》，2(9):1028
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1032；YE等人,2000，《科学(Science)》283:88
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91；Rivera等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》，第96卷(15):8657
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8662，1999)。
[0003]如J.Naidoo和D.Young的《国际神经病学研究(Neurology Research International)》第2012卷，文章ID 595410，10页，(2011)所总结的，雷帕霉素调节的基因调节系统依赖于两个转录因子之间的相互作用，一个整合DNA结合结构域并且另一个整合DNA激活结构域。每个转录因子还含有异源配体结合结构域，该异源配体结合结构域能够在二聚化药物雷帕霉素的存在下相互作用以驱动转基因表达。通过人CMV启动子驱动的锌指同源结构域
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1(ZFHD1)DNA结合结构域的产生促进DNA结合，该锌指同源结构域
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1(ZFHD1)DNA结合结构域融合至三个拷贝的FK结合蛋白(FKBP)。在雷帕霉素存在下实现转基因表达，雷帕霉素诱导该DNA结合蛋白与融合蛋白的二聚化，该融合蛋白由融合至NFκB p65激活结构域的FKBP
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雷帕霉素相关蛋白1(FRAP)组成。
[0004]虽然这些系统在非人类动物的治疗中将是有益的，但是已经报道的所有系统都基于人类序列。因此，需要适用于非人类治疗的可调节系统。

技术实现思路

[0005]本文提供了包含诱导型基因表达系统的核酸分子、载体和重组AAV。
[0006]在第一方面，提供了包含诱导型基因表达系统的核酸分子。该系统包括：转基因，其编码与包含启动子的表达控制序列可操作地连接的基因产物；激活结构域，其包含犬科动物或猫科动物反式激活结构域和犬科动物或猫科动物FKBP12
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雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的FKBP12
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雷帕霉素结合(FRB)结构域；DNA结合结构域，其包含锌指同源结构域(ZFHD)和一个、两个或三个FK506结合蛋白结构域(FKBP)亚基基因；和至少8个拷贝的ZFHD结合位点(8XZFHD)，随后是最小IL2启动子。有效量的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的存在诱导转基因在宿主细胞中表达。
[0007]另一方面，提供了核酸分子。该分子包括启动子；激活结构域，其包含犬科动物或
猫科动物p65反式激活结构域和犬科动物或猫科动物FKBP12
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雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的FKBP12
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雷帕霉素结合(FRB)结构域；DNA结合结构域，其包含锌指同源结构域(ZFHD)和三个FK506结合蛋白结构域(FKBP)亚基基因；8个拷贝的ZFHD结合位点和治疗产物的编码序列。
[0008]在另一方面，提供了包含核酸分子的病毒载体，该核酸分子包含本文所描述的诱导型基因表达系统。
[0009]在另一方面，提供了包含核酸分子的重组AAV(rAAV)，该核酸分子包含本文所描述的诱导型基因表达系统。
[0010]在另一方面，提供了用于调节治疗产物的剂量的治疗方案。该方案包括将本文所描述的rAAV组合物施用于需要其的受试者，并且递送有效量的雷帕霉素或雷帕霉素类似物以诱导治疗产物在受试者的宿主细胞中表达。在一个实施例中，受试者是犬科动物或猫科动物。
[0011]根据下面对本专利技术的详细描述，本专利技术的其它方面和优点将变得显而易见。
附图说明
[0012]图1是示出cTF.rhEpo.3w.rBG(犬科动物诱导型盒)的质粒图谱。
[0013]图2是示出fTF.rhEpo.3w.rBG(猫科动物诱导型盒)的质粒图谱。
[0014]图3是示出rhEPO体外表达的图。用表达恒河猴Epo(rhEpo)的hTF.rhEpo.3w.rBG(人类诱导型盒)、cTF.rhEpo.3w.rBG(犬科动物诱导型盒)或fTF.rhEpo.3w.rBG(猫科动物诱导型盒)转染HEK293细胞。转染后一天用0nM、4nM或40nM雷帕霉素处理细胞。收集培养物上清液并且在雷帕霉素处理后48小时测量rhEpo。
[0015]图4提供了猫科动物诱导型构建体feFRB
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p65(SEQ ID NO:36)和feZFHD1
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3xFKBP(SEQ ID NO:37)，以及犬科动物诱导型构建体caFRB
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p65(SEQ ID NO:38)和caZFHD1
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3xFKBP(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列。
具体实施方式
[0016]本文所描述的核酸、载体和病毒被设计成允许对受试者施用一次基因治疗，之后通过施用口服诱导物开启转基因。这允许定期口服药物代替生物药物的频繁注射。在一个实施例中，受试者是犬科动物。在另一实施例中，受试者是猫科动物。
[0017]尽管所有先前可获得的系统都基于来自人类或其它物种的蛋白质，但本文提供的是AAV包装的构建体，其完全包含在兽医应用中具有更好的安全特性和降低的免疫原性的犬科动物和猫科动物氨基酸序列。
[0018]应注意，术语“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或多个。因此，术语“一个(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
[0019]虽然本说明书中的各种实施例使用“包含”语言来呈现，但在其它情况下，相关实施例也旨在使用“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”语言来解释和描述。词本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含诱导型基因表达系统的核酸分子，所述系统包含：(a)转基因，其编码可操作地连接至包含启动子的表达控制序列的基因产物；(b)激活结构域，其包含犬科动物或猫科动物反式激活结构域和犬科动物或猫科动物FKBP12
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雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的FKBP12
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雷帕霉素结合(FRB)结构域；(c)DNA结合结构域，其包含锌指同源结构域(ZFHD)和一个、两个或三个FK506结合蛋白结构域(FKBP)亚基基因；以及(d)至少一个拷贝的ZFHD结合位点，随后是最小IL2启动子，其中有效量的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的存在诱导所述转基因在宿主细胞中表达。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其进一步包含5'AAV ITR和3'AAV ITR。3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述FKBP亚基基因序列彼此共有小于约85％的同一性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述FKBP亚基基因序列中的一个是天然FKBP基因序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述反式激活结构域包含NF
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κB p65的一部分。6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中所述反式激活结构域是犬科动物p65序列。7.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中所述反式激活结构域是猫科动物p65序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是组成型启动子。9.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是组织特异性启动子。10.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是CMV启动子。11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸分子，其进一步包含IRES。12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸分子，其包含至少8个拷贝的所述ZFHD结合位点。13.一种核酸分子，其包含：启动子；激活结构域，其包含犬科动物或猫科动物p65反式激活结构域和犬科动物或猫科动物FKBP12
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雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的FKBP12
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雷帕霉素结合(FRB)结构域；DNA结合结构域，其包含锌指同源结构域(ZFHD)和三个FK506结合蛋白结构域(FKBP)亚基基因；8个拷贝的ZFHD结合位点和治疗产物的编码序列。14.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸分子，其中：所述FRB结构域具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2共有至少90％、95％、96％、96％、98％、99％或100％同一性的序列；和/或p65亚基具有与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5共有至少90％、95％、96％、96％、98％、99％或100％同一性的序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：