【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、位点特异性核酸酶(例如crispr-cas9或大范围核酸酶)在染色体中产生双链断裂(dsb)，导致了dna修复。在供体dna存在的情况下，发生同源性定向修复(hdr)，并用来自供体基因的新信息替换染色体中的遗传信息。
2、同源定向修复(hdr)是使用dna模板通过同源重组修复dna双链断裂(dsb)的过程。该模板可以来自细胞周期后期s期或g2期的细胞内，此时姐妹染色单体在有丝分裂完成之前可用。此外，可将外源修复模板递送到细胞中，最常见的是以合成的单链dna供体寡核苷酸或供体质粒的形式，以在基因组中产生精确的变化。
3、安全港位点(shs)是可以安全插入和表达基因或其他遗传元件的基因组基因座。这些shs对于有效的人类疾病基因治疗；对于研究基因结构、功能和调控；以及对于细胞标记和示踪至关重要。
4、所需要的是用于基因编辑的改进的组合物和方法。
技术实现思路
1、本文提供了用于基因编辑的组合物、方法、系统和试剂盒，其允许天然pcsk9基因的敲低或消融以及外源转基因在pcsk9基因座中的插入和/或表达。
2、在第一方面，本文提供了用于治疗遗传性疾患的系统。该系统包括基因编辑组件，该组件包含表达盒，该表达盒包含编码靶向pcsk9基因的核酸酶的核酸序列和指导核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列。该系统还包括供体载体，该供体载体包含转基因盒，该转基因盒包含编码转基因的核酸序列和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，该
3、在一些实施例中，基因编辑组件包含编码cas9的序列。在某些实施例中，基因编辑载体进一步包含编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。
4、在其它实施例中，供体载体进一步包含编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。
5、在另一方面，本文提供了用于治疗遗传性疾患的系统。该系统包括基因编辑组件，其包含编码靶向pcsk9基因的核酸酶的核酸序列。该系统还包括供体载体，该供体载体包含转基因盒，该转基因盒包含编码转基因的核酸序列和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，该供体载体进一步包含该转基因盒5′和3′的同源定向重组(hdr)臂，其中该转基因不是pcsk9。核酸酶靶向pcsk9基因。在某些实施例中，基因编辑组件以脂质纳米颗粒的形式提供。
6、在一些实施例中，基因编辑组件包含编码cas9的序列。在某些实施例中，基因编辑载体进一步包含编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。
7、在其它实施例中，供体载体的另外的组分包含编码包含至少20个核苷酸种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。
8、在某些实施例中，转基因涉及肝代谢疾患。在某些实施例中，转基因是otc、pku、ctln1或ldlr。
9、在某些实施例中，载体是腺相关病毒(aav)载体，并且载体包含aav 5′itr和aav3′itr。
10、在另一个实施例中，用于治疗遗传性疾患的双载体系统包括基因编辑aav，其包含aav衣壳和第一载体基因组，该第一载体基因组包含：5′itr，编码大范围核酸酶的序列，所述大范围核酸酶在指导所述大范围核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列控制下靶向pcsk9，和3′itr；以及供体aav载体，其包含aav衣壳和第二载体基因组，该第二载体基因组包含：5′itr、5′同源定向重组(hdr)臂、转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，3′hdr臂和3′itr，其中该转基因不编码pcsk9。
11、在另一个实施例中，用于治疗遗传性疾患的双载体系统包括基因编辑aav，其包含aav衣壳和第一载体基因组，该第一载体基因组包含5′itr、5′核定位信号(nls)、编码cas9的序列和指导sacas9在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列、3′nls和3′itr；和供体aav载体，其包含aav衣壳和第二载体基因组，该第二载体基因组包含：5′itr、5′同源定向重组(hdr)臂、转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，3′hdr臂、u6启动子、包含特异性结合pcsk9基因中的靶位点的至少20个核苷酸的sgrna，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′，和3′itr，其中该转基因不编码pcsk9。
12、在另一个实施例中，用于治疗遗传性疾患的双载体系统包括基因编辑aav载体，其包含aav衣壳和第一载体基因组，该第一载体基因组包含5′itr、u6启动子、包含特异性结合该pcsk9基因中的靶位点的至少20个核苷酸的sgrna，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′，5′核定位信号(nls)、编码cas9的序列和指导cas9在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列、3′nls和3′itr；和供体aav载体，其包含aav衣壳和第二载体基因组，该第二载体基因组包含：5′itr、5′同源定向重组(hdr)臂、转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，3′hdr臂和3′itr。
13、在一些实施例中，基因编辑aav载体和供体aav载体具有相同的aav衣壳。在其它实施例中，基因编辑aav载体和供体aav载体具有不同的aav衣壳。在一些实施例中，aav衣壳选自aav8、aav9、rh10、aav6.2、aav3b、hu37、rh79和rh64。
14、在另一方面，提供了通过共同施用本文所述的双载体系统来治疗人类疾患的方法。
15、在另一方面，提供了在受试者中治疗肝代谢疾患的方法，该方法包括向患有肝代谢疾患的受试者共同施用基因编辑aav载体，该载体包含编码核酸酶的序列和指导核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列，以及供体aav载体，其包含转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，该供体载体进一步包含转基因盒5′和3′的同源定向重组(hdr)臂，其中该转基因不是pcsk9。在某些实施例中，肝脏代谢疾患是鸟氨酸氨甲酰基转移酶。在其它实施例中，家族性高胆固醇血症或苯丙酮尿症。在一个实施例中，受试者是新生儿。
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1.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
2.根据权利要求1所述的系统，进一步包含指导所述核酸酶在包含PCSK9基因的靶细胞中的表达的调控序列
3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，其中所述核酸酶靶向PCSK9外显子7。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述核酸酶是针对PCSK9特异性的大范围核酸酶。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述大范围核酸酶是ARCUS大范围核酸酶。
6.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述基因编辑载体包含侧翼为核定位信号的编码Cas9的序列。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述基因编辑载体进一步包含含有至少20个核苷酸的sgRNA，所述sgRNA特异性结合所述PCSK9基因中的靶位点，所述靶位点位于被所述Cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(PAM)的5′。
8.根据权利要求6所述的系统，其中所述供体载体进一步包含含有至少20个核苷酸的种子区的sgRNA，其中所述sgRNA特异性结合所述PCSK9基因中的靶位点，所述靶位点位于被所述C
9.根据权利要求6至8中任一项所述的系统，进一步包含RNA聚合酶启动子。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述RNA聚合酶启动子是U6启动子。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述U6启动子位于所述sgRNA的5′。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的系统，其中所述种子区与所述靶位点序列100％互补。
13.根据权利要求7至11中任一项所述的系统，其中所述种子区与所述靶位点序列小于100％互补。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的系统，其中所述转基因是OTC、PKU、CTLN1或LDLR。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的系统，其中所述供体载体和基因编辑载体中的至少一者为腺相关病毒(AAV)载体，并且所述AAV载体包含AAV 5′ITR和AAV 3′ITR。
16.根据权利要求15所述的系统，其中(a)的基因编辑AAV载体与(b)的供体AAV载体的比率使得(b)的供体AAV载体超过(a)的基因编辑载体。
17.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
18.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
19.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
20.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
21.根据权利要求17至19中任一项所述的系统，其中(a)的所述基因编辑AAV载体和(b)的所述供体AAV载体具有相同的AAV衣壳。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述AAV衣壳选自AAV8、AAV9、rh10、AAV6.2、AAV3B、hu37、rh79和rh64。
23.根据权利要求6至18或18至22中任一项所述的系统，其中Cas9选自金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌Cas9。
24.根据权利要求2至19中任一项所述的系统，其中所述核酸酶处于组织特异性启动子的控制之下。
25.根据权利要求2至19中任一项所述的系统，其中所述核酸酶处于组成型启动子的控制之下。
26.根据权利要求24所述的系统，其中所述核酸酶处于肝特异性启动子的控制之下，任选地为人甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子或杂合肝启动子(HLP)。
27.一种通过共同施用根据权利要求1至26中任一项所述的系统来治疗人类疾患的方法。
28.一种在新生儿受试者中治疗肝代谢疾患的方法，所述方法包括：向患有肝代谢疾患的所述受试者共同施用：
29.根据权利要求28所述的方法，其中(a)的所述基因编辑AAV载体和(b)的所述供体载体经由相同途径基本上同时递送。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中(a)的所述基因编辑AAV载体以约2x1011GC/mL至约2x1012GC/mL的浓度悬浮于注射用载剂中。
31.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中(a)的所述AAV靶向载体以约2x1012GC/mL至约1x1013GC/mL的浓度悬浮于注射用载剂中。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述肝代谢疾患是鸟氨酸氨甲酰基转移酶。
33.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述肝代谢疾患是OTC、FH、瓜氨酸血症I型(CTLN1)或苯丙酮尿症。
34.一...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
2.根据权利要求1所述的系统，进一步包含指导所述核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列
3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，其中所述核酸酶靶向pcsk9外显子7。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述核酸酶是针对pcsk9特异性的大范围核酸酶。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述大范围核酸酶是arcus大范围核酸酶。
6.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述基因编辑载体包含侧翼为核定位信号的编码cas9的序列。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述基因编辑载体进一步包含含有至少20个核苷酸的sgrna，所述sgrna特异性结合所述pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被所述cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。
8.根据权利要求6所述的系统，其中所述供体载体进一步包含含有至少20个核苷酸的种子区的sgrna，其中所述sgrna特异性结合所述pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被所述cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的系统，进一步包含rna聚合酶启动子。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述rna聚合酶启动子是u6启动子。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述u6启动子位于所述sgrna的5′。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的系统，其中所述种子区与所述靶位点序列100％互补。
13.根据权利要求7至11中任一项所述的系统，其中所述种子区与所述靶位点序列小于100％互补。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的系统，其中所述转基因是otc、pku、ctln1或ldlr。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的系统，其中所述供体载体和基因编辑载体中的至少一者为腺相关病毒(aav)载体，并且所述aav载体包含aav 5′itr和aav 3′itr。
16.根据权利要求15所述的系统，其中(a)的基因编辑aav载体与(b)的供体aav载体的比率使得(b)的供体aav载体超过(a)的基因编辑载体。
17.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
18.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
19.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
20.一种用于治疗遗传性疾患的系统，所述系统包括：
21.根据权利要求17至19中任一项所述的系统，其中(a)的所述基因编辑aav载体和(b)的所述供体aav载体具有相同的aav衣壳。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述aav衣壳选自aav8、aav9、rh10、aav6.2、aav3b、hu37、rh79和rh64。
23.根据权利要求6至18或18至22中任一项所述的系统，其中cas9选自金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌cas9。
24.根据权利要求2至19中任一项所述的系统，其中所述核酸酶处于组织特异性启动子的控制之下。
25.根据权利要求2至19中任一项所述的系统，其中所述核酸酶处于组成型启动子的控制之下。
26.根据权利要求24所述的系统，其中所述核酸酶处于肝特异性启动子的控制之下，任选地为人甲状腺素结合...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·王，J·M·威尔逊，A·特雷季亚科娃，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：
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