【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术中的基因工程领域，具体涉及一种基于胞嘧啶脱氨酶cda1构建的c-to-g碱基编辑系统。
技术介绍
1、基因组编辑技术是对生物的基因组进行定向修饰的一种基因工程技术。crispr/cas9系统是目前最为常用的基因组编辑系统，其通过向导rna靶向目标位点，cas9蛋白对靶位点进行切割产生双链断裂(dsb)，通常引发非同源末端连接修复(nhej)机制，导致靶位点产生随机的碱基插入/缺失(indels)，从而导致基因沉默或丧失功能。但是，由于修复结果是随机的，crispr/cas9系统难以准确引入点突变。基于crispr/cas9构建的碱基编辑器(base editors，bes)可在不引起dsb的情况下，对靶位点进行特定碱基转换。目前主流的碱基编辑器主要有胞嘧啶碱基编辑器(cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(abe)，可实现c-to-t和a-to-g之间的碱基替换，已广泛应用于人类疾病动物模型构建、临床试验、植物基因功能验证和作物改良等领域。近年来，可实现碱基颠换的cgbe、aybe等碱基编辑器也相继出现。目前cgbe碱基编辑器主要基于cbe开发，通过去掉尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)或将其替换为尿嘧啶糖基化酶(ung)，或融合碱基切除修复(ber)通路相关蛋白，提高c-to-g的效率和纯度。目前主流cgbe工具的编辑窗口受限于pam远端的第5-9位，且具有wc(w=a/t)基序偏好性，限制了现有cgbe工具的广泛应用。
技术实现思路
1、针对目前碱基编辑工具的不足，本专利
2、本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
3、第一专利技术，本专利技术保护一种c-to-g碱基编辑系统，所述c-to-g碱基编辑系统含有如下a1)或a2)：
4、a1)来源于海七鳃鳗( petromyzon marinus)的胞嘧啶脱氨酶pmcda1(以下简称cda1)或不同截短长度的胞嘧啶脱氨酶cda1、来源于化脓链球菌( streptococcus pyogenes)的spcas9切口酶(ncas9(d10a))和核定位信号nls的融合蛋白，含有该融合蛋白的统称为cda1 minicgbe碱基编辑系统；
5、a2)来源于海七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶cda1或不同截短长度的胞嘧啶脱氨酶cda1、来源于化脓链球菌的spcas9切口酶(ncas9(d10a))、来源于酿酒酵母( saccharomyces cerevisiae)的尿嘧啶-dna糖基化酶ung1和核定位信号(nls)的融合蛋白，含有该融合蛋白的统称为cda1 cgbe碱基编辑系统。
6、在具体的实施方案中，本专利技术中所述的(a1)和(a2)两种融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶cda1被截短为不同长度。
7、在具体的实施方案中，所述c-to-g碱基编辑系统中的融合蛋白具体选自如下b1)-b4)中的任一种：
8、b1)全长为cda1，融合于a1)或a2)结构中，且融合于ncas9(d10a) c端的融合蛋白，含有该融合蛋白的碱基编辑系统称为ccda1-minicgbe或ccda1-cgbe；
9、b2)全长为cda1，融合于a1)和a2)结构中，且融合于ncas9(d10a) n端的融合蛋白，含有该融合蛋白的碱基编辑系统称为cda1-minicgbe或cda1-cgbe；
10、b3)cda1从c端截短记为cda1δ，截短至195，194，193，192，190，188个氨基酸，分别命名为cda1δ195，cda1δ194，cda1δ193，cda1δ192，cda1δ190，cda1δ188，融合于a1)结构中；截短至195，194，193，192，190，188，182，176，167，161，158，150个氨基酸，分别命名为cda1δ195，cda1δ194，cda1δ193，cda1δ192，cda1δ190，cda1δ188，cda1δ182，cda1δ176，cda1δ167，cda1δ161，cda1δ158，cda1δ150，融合于a2)结构中；
11、b4)cda1从n端截短至第28个氨基酸序列，从c端截短至第161个氨基酸序列，命名为cda1δn28-161，融合于a2)结构中。
12、所述胞嘧啶脱氨酶cda1除ccda1-minicgbe和ccda1-cgbe外，其余所有长度的cda1皆融合于ncas9(d10a)的n端。
13、所述cda1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列。
14、优选地，所述cda1δ195氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列。
15、优选地，所述cda1δ194氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列。
16、优选地，所述cda1δ193氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列。
17、优选地，所述cda1δ192氨基酸序列包括seq id no.5所示的序列。
18、优选地，所述cda1δ190氨基酸序列包括seq id no.6所示的序列。
19、优选地，所述cda1δ188氨基酸序列包括seq id no.7所示的序列。
20、优选地，所述cda1δ182氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列。
21、优选地，所述cda1δ176氨基酸序列包括seq id no.9所示的序列。
22、优选地，所述cda1δ167氨基酸序列包括seq id no.10所示的序列。
23、优选地，所述cda1δ161氨基酸序列包括seq id no.11所示的序列。
24、优选地，所述cda1δ158氨基酸序列包括seq id no.12所示的序列。
25、优选地，所述cda1δ150氨基酸序列包括seq id no.13所示的序列。
26、优选地，所述cda1δn28-161氨基酸序列包括seq id no.14所示的序列。
27、seq id no.1：
28、mtdaeyvrihekldiytfkkqffnnkksvshrcyvlfelkrrgerracfwgyavnkpqsgtergihaeifsirkveeylrdnpgqftinwysswspcadcaekilewynqelrgnghtlkiwacklyyeknarnqiglwnlrdngvglnvmvsehyqccrkifiqsshnqlnenrwlektlkraekrrselsimiqvkilhttkspav
29、seq id no.2：
30、m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种C-to-G碱基编辑系统，其特征在于，所述C-to-G碱基编辑系统含有融合蛋白，所述融合蛋白选自如下(A1)或(A2)：
2. 根据权利要求1所述的C-to-G碱基编辑系统，其特征在于，所述UNG1融合于nCas9(D10A)的C端；所述的UNG1氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
3. 根据权利要求1所述的C-to-G碱基编辑系统，其特征在于，所述核定位信号NLS融合于nCas9(D10A)或UNG1的C端；所述NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.根据权利要求1所述的C-to-G碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统还包括sgRNA或sgRNA表达载体。
5.权利要求1-4任一所述的C-to-G碱基编辑系统在基因编辑、制备基因编辑的产品或提高基因编辑精准性中的应用。
6.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自如下(A1)或(A2)：
7.编码权利要求6所述的融合蛋白的核酸分子。
8.与权利要求7所述核酸分子相关的生物材料，所述生物材料为下述
9.权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的生物材料在如下(D1)-(D4)任一中的应用：
10.一种提高C-to-G碱基编辑系统的编辑精准性的方法，所述方法通过将权利要求6所述的融合蛋白和编码sgRNA的核酸分子形成复合体，制备基因编辑载体进行编辑。
...【技术特征摘要】
1.一种c-to-g碱基编辑系统，其特征在于，所述c-to-g碱基编辑系统含有融合蛋白，所述融合蛋白选自如下(a1)或(a2)：
2. 根据权利要求1所述的c-to-g碱基编辑系统，其特征在于，所述ung1融合于ncas9(d10a)的c端；所述的ung1氨基酸序列如seq id no.15所示。
3. 根据权利要求1所述的c-to-g碱基编辑系统，其特征在于，所述核定位信号nls融合于ncas9(d10a)或ung1的c端；所述nls的氨基酸序列如seq id no.16所示。
4.根据权利要求1所述的c-to-g碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统还包括sgrna或sgrna表达载体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：谭俊杰，李铮，赵薇，李绍康，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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