【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单分子检测，具体地说是一种微液滴单分子检测系统及其检测方法。
技术介绍
1、微液滴技术是通过微流通道结构和水力控制来生成纳升或者微升级别的乳化液滴。在微通道生成的液滴分散在另一相流体中，这样试剂不会对通道进行浸润，并且可以在微通道内部进行自由运动。微液滴技术表现出其独特的优点如：液滴尺寸控制、实验重复性好、反应效率高、高通量、降低交叉反应。
2、单分子检测技术（single molecule detection, smd）是一种能够在单个分子水平上进行检测和计量的技术。它通过特定的检测方法，如荧光显微镜等，实现对单个分子的分析和识别。这种技术的具有高灵敏度、高精确性、无需扩增、快速性、宽动态范围等优点。但是该技术也存在技术要求高、易受干扰、样本需求高等缺点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种微液滴单分子检测系统及其检测方法。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案解决的：
3、一种微液滴单分子检测系统，其特征在于：该检测系统包括微液滴生成模块、恒温反应模块、荧光检测模块，其中，
4、微液滴生成模块用于将待检测的靶标样品、标记后的捕获抗体、标记后的检测抗体和油生成油包水的单层排布的微液滴；
5、恒温反应模块：用于放置微液滴生成模块，使微液滴生成模块内单层排布的微液滴在恒温状态下反应，产生能被检测到的荧光信号；
6、荧光检测模块：用于检测经过恒温反应后的微液滴生成模
7、所述的微液滴生成模块采用微液滴单分子检测芯片，该微液滴单分子检测芯片包括微液滴储存区，在微液滴储存区的一端设置有微液滴梯度通道，微液滴梯度通道的进口端布置有靶标样品通道、捕获抗体通道、检测抗体通道和油相通道且油相通道的出口端垂直于微液滴梯度通道的进口端设置，在靶标样品通道、捕获抗体通道、检测抗体通道和油相通道上分别配置有气泵；在各个气泵的驱动下，从靶标样品通道输入待检测的靶标样品、从捕获抗体通道输入标记后的捕获抗体、从检测抗体通道输入标记后的检测抗体与从油相通道输入的油在微液滴梯度通道的进口端相遇，靶标样品、捕获抗体和检测抗体相遇形成的混合液在油的剪切力作用下，形成油包水的微液滴进入微液滴储存区并呈单层排布状态。
8、所述的靶标样品通道和捕获抗体通道分别位于微液滴梯度通道延长方向的两侧、检测抗体通道位于捕获抗体通道的外侧、且油相通道位于靶标样品通道的外侧。
9、所述微液滴梯度通道的倾斜处的倾角为45°-90°，梯度的设置保证了微液滴储存区内的单分子微液滴不会倒流；所述微液滴储存区的内腔高度为10μm-15μm，以保证单分子微液滴呈现单层排布。
10、所述微液滴生成模块内生成的单层排布的微液滴的直径大小为10μm-15μm。
11、待检测的靶标样品中含有50mm mg2+、25mm na+。
12、所述的恒温反应模块采用恒温金属浴。
13、所述恒温反应模块的温度控制范围为25℃-37℃；所述恒温反应模块的恒温反应时长为12min-20min，优选15min-20min。
14、所述的荧光检测模块采用荧光检测仪，荧光检测仪能够对微液滴生成模块内单层排布的微液滴进行荧光成像，并对荧光成像后的图片进行微液滴分析，获得保持完整形貌的微液滴数量以及其中含有荧光信号的微液滴数量，按照保持完整形貌的微液滴中的含有荧光信号的微液滴数量与保持完整形貌的微液滴数量之比计算信号比，实现定量。
15、具体地，荧光检测仪利用ccd或者显微镜识别微液滴储存区内的微液滴是否具有完整形貌以及荧光信号差异，并利用软件读取统计单层排布的微液滴产生的荧光信号以实现对于靶标样品的定量单分子检测。
16、微液滴是否具有完整形貌的标准在于微液滴是否保持油包水状态，即微液滴未出现破损。
17、一种微液滴单分子检测系统的检测方法，其特征在于：该检测方法步骤如下：
18、a、在气泵驱动下，将待检测的靶标样品、标记后的捕获抗体、标记后的检测抗体和油输入微液滴生成模块，生成油包水的单层排布的微液滴；
19、b、将内有单层排布的微液滴的微液滴生成模块放入恒温反应模块内，进行12min-20min的恒温反应，使得恒温反应后的微液滴能够产生荧光信号；
20、c、将恒温反应后的微液滴生成模块放入荧光检测模块内，识别微液滴生成模块内单层排布的微液滴是否具有完整形貌以及具有完整形貌的微液滴的荧光信号差异并分别进行计数，从而对靶标样品进行定量单分子检测。
21、由于单分子检测技术和微液滴技术各自具有一定的优势，本专利技术将这两种技术融合能够充分发挥它们的优势，进一步提高检测的准确性和效率；微液滴作为单分子检测的载体，将单个分子封装在微液滴中，便于进行单分子检测；这样能够避免在检测过程中分子间的相互干扰，提高检测的准确性和灵敏度，减少反应时间；同时利用单分子检测技术对微液滴中的单个分子进行检测和分析，能获得更精确的检测结果。
22、本专利技术相比现有技术有如下优点：
23、本专利技术的检测系统无需复杂仪器设备，只需微液滴单分子检测芯片、恒温金属浴及荧光检测仪，所有仪器设备结构简单，而不需大型仪器。
24、本专利技术提出的微液滴单分子检测系统具有灵敏度高且检测范围适宜的优点，更直接且检测限低，并且操作简单，检测时间短，生物相容性好，光学性能好。
25、本专利技术提出的检测方法无需变温，全程等温操作，且后续读取简便，检测时间短，通过对微液滴荧光信号计数实现绝对定量。
26、本专利技术提出的检测方法通过将微液滴技术和单分子检测技术相结合，在等温条件下实现核酸检测或者免疫检测，避免检测过程中的相互干扰，最终通过荧光信号实现绝对定量，检测范围为1-200ng/ml、甚至更高，检测限为0.8ng/ml，单分子检测时能显著提高检测的灵敏度。
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1.一种微液滴单分子检测系统，其特征在于：该检测系统包括微液滴生成模块、恒温反应模块、荧光检测模块，其中，
2.根据权利要求1所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述的微液滴生成模块采用微液滴单分子检测芯片（10），该微液滴单分子检测芯片（10）包括微液滴储存区（6），在微液滴储存区（6）的一端设置有微液滴梯度通道（5），微液滴梯度通道（5）的进口端布置有靶标样品通道（1）、捕获抗体通道（2）、检测抗体通道（3）和油相通道（4）且油相通道（4）的出口端垂直于微液滴梯度通道（5）的进口端设置，在靶标样品通道（1）、捕获抗体通道（2）、检测抗体通道（3）和油相通道（4）上分别配置有气泵；在各个气泵的驱动下，从靶标样品通道（1）输入待检测的靶标样品、从捕获抗体通道（2）输入标记后的捕获抗体、从检测抗体通道（3）输入标记后的检测抗体与从油相通道（4）输入的油在微液滴梯度通道（5）的进口端相遇，靶标样品、捕获抗体和检测抗体相遇形成的混合液在油的剪切力作用下，形成油包水的微液滴进入微液滴储存区（6）并呈单层排布状态。
3.根据权利要求2所述的微液滴单分子检测系统，
4.根据权利要求2所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述微液滴梯度通道（5）的倾斜处的倾角为45°-90°；所述微液滴储存区（6）的内腔高度为10μm-15μm。
5. 根据权利要求1所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：待检测的靶标样品中含有50mM Mg2+、25mM Na+。
6.根据权利要求1所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述的恒温反应模块采用恒温金属浴。
7.根据权利要求1所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述恒温反应模块的恒温反应时长为15min-20min。
8.根据权利要求1所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述的荧光检测模块采用荧光检测仪，荧光检测仪能够对微液滴生成模块内单层排布的微液滴进行荧光成像，并对荧光成像后的图片进行微液滴分析，获得保持完整形貌的微液滴数量以及其中含有荧光信号的微液滴数量，按照保持完整形貌的微液滴中的含有荧光信号的微液滴数量与保持完整形貌的微液滴数量之比计算信号比，实现定量。
9.一种如权利要求1-8任一所述的微液滴单分子检测系统的检测方法，其特征在于：该检测方法步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种微液滴单分子检测系统，其特征在于：该检测系统包括微液滴生成模块、恒温反应模块、荧光检测模块，其中，
2.根据权利要求1所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述的微液滴生成模块采用微液滴单分子检测芯片（10），该微液滴单分子检测芯片（10）包括微液滴储存区（6），在微液滴储存区（6）的一端设置有微液滴梯度通道（5），微液滴梯度通道（5）的进口端布置有靶标样品通道（1）、捕获抗体通道（2）、检测抗体通道（3）和油相通道（4）且油相通道（4）的出口端垂直于微液滴梯度通道（5）的进口端设置，在靶标样品通道（1）、捕获抗体通道（2）、检测抗体通道（3）和油相通道（4）上分别配置有气泵；在各个气泵的驱动下，从靶标样品通道（1）输入待检测的靶标样品、从捕获抗体通道（2）输入标记后的捕获抗体、从检测抗体通道（3）输入标记后的检测抗体与从油相通道（4）输入的油在微液滴梯度通道（5）的进口端相遇，靶标样品、捕获抗体和检测抗体相遇形成的混合液在油的剪切力作用下，形成油包水的微液滴进入微液滴储存区（6）并呈单层排布状态。
3.根据权利要求2所述的微液滴单分子检测系统，其特征在于：所述的靶标样品通道（1）和捕获抗体通道（2）分别位于微液滴梯度通道（5）延长方向的两侧、检测抗体通道（3...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘斐，吉峙润，单衍可，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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