【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白工程领域，涉及一种新的cry31aa蛋白及其应用。
技术介绍
1、植物寄生线虫是农作物主要病原物之一,每年造成作物大幅度减产和严重的经济损失，严重地块可达30％-50％，局部地区可造成80％以上的经济损失。随着全球气候变化、种植制度改革以及规模化、机械化农业的迅猛发展，植物线虫病害呈严重发生趋势，并上升为我国第二大植物病害。
2、苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis，bt)是一类短杆状革兰氏阳性细菌，其典型特征是能够产生具有杀虫活性的伴胞晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，简称icps),icps是bt菌株的主要毒力因子，决定着bt菌株的致病性。而这些毒力因子的高效性和特异性使bt菌株可以安全用于农作物多种虫害防治，被人们认为是种绿色、安全的微生物杀虫剂，这也使bt菌株成为目前应用最成功的微生物农药之一。
3、目前cry蛋白约有75个主要亚组，即cry1至cry75等，由770个成员组成。它们的大小存在很大差异，其中最小的是cry34蛋白有369个氨基酸，最大是cry43蛋白，有1344个氨基酸。根据crickmore等人在2021年公布的细菌杀虫蛋白新命名标准，cry蛋白的序列同源性在0到44％时达到一级分类标准，二级和三级分别代表具有45％-75％和76％-94％序列同源性的蛋白质，四级则是>95％的同源性蛋白。
4、bt制剂及cry蛋白防治植物线虫病害提供了新的方向，但目前发现具有杀线虫活性的cry蛋白种类
5、很多研究已报道害虫已对现有的cry毒素表现出抗性，为避免因害虫产生抗性带来经济损失，挖掘新型高效的cry毒素是一种有效途径，而且对我国生物防治领域快速发展具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的cry31aa蛋白。
2、本专利技术的另一目的是提供该蛋白的应用。
3、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
4、cry31aa蛋白，氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术所述的cry31aa蛋白的编码基因cry31aa。
6、作为本专利技术的一种优选，所述的编码基因核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、本专利技术利用seqhunter 2软件筛选了gbac46菌株(wu et al.,2019)全基因组，结果在该菌株中预测到3个未知的cry基因，cry31aa就是其中之一。其中cry31aa蛋白含有802个氨基酸，大小为90.257kda，其n端第110-338位氨基酸为delta内毒素杀虫结构域，一旦被激活该功能域可以靶标肠道上皮细胞，可能涉及到细胞膜的插入和“孔”的形成，从而使肠道细胞死亡。c端第524-659位氨基酸是cbm6(carbohydrate binding module 6)功能域，通过与碳水化合物结合方式决定杀线虫的特异性。活性功能域由3个结构域(three domains,3d)组成的cry蛋白被称为3d-cry蛋白，其中domainⅰ是由亲水的α螺旋束组成，domainⅱ和domainⅲ则是富含β折叠，domainⅱ和domainⅲ也决定着cry蛋白与受体的结合(vilchez,2020)。利用swiss-model网站对cry31aa蛋白三维结构进行预测分析，发现cry31aa蛋白富含α螺旋和β折叠(图1)，推测cry31aa蛋白可能为3d-cry蛋白，即cry31aa蛋白可能是穿孔毒素。
8、含有所述cry31aa蛋白的编码基因的重组表达载体。
9、含有所述cry31aa蛋白的编码基因的基因工程菌。
10、作为本专利技术的一种优选，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
11、所述的cry31aa蛋白在防治线虫中的应用，优选在防除水稻根尖线虫病中的应用。
12、所述的cry31aa蛋白在制备防治线虫病的生物农药中的应用，优选在制备防除水稻根尖线虫病的生物药物中的应用。
13、所述的编码基因、所述的重组表达载体、所述的基因工程菌在制备防治线虫病的生物农药中的应用，优选在制备防除水稻根尖线虫病的生物药物中的应用。
14、利用所述的基因工程菌异源表达权利要求1所述的cry31aa蛋白，对蛋白进行分离纯化，并用蛋白酶进行活化得到具有杀灭线虫作用的cry31aa蛋白。
15、有益效果：
16、本专利技术从gbac46菌株中挖掘到一个新的cry基因及其编码的cry蛋白，cry31aa蛋白含有802个氨基酸，大小为90.257kda，其n端第110-338位氨基酸为delta内毒素杀虫结构域，一旦被激活该功能域可以靶标肠道上皮细胞，可能涉及到细胞膜的插入和“孔”的形成，从而使肠道细胞死亡。c端第524-659位氨基酸是cbm6(carbohydrate binding module 6)功能域，通过与碳水化合物结合方式决定杀线虫的特异性。通过cry蛋白对线虫毒性检测发现，cry31aa蛋白有杀水稻干尖线虫活性，其ec50值是131.80ug/ml，回归方程是y＝458.22x-10.395，r2＝0.9087。cry31aa蛋白能够被水稻干尖线虫吞食进入肠道，破坏线虫肠道细胞膜。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.Cry31Aa蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的Cry31Aa蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.含有权利要求2或3所述Cry31Aa蛋白的编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2或3所述Cry31Aa蛋白的编码基因的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
7.权利要求1所述的Cry31Aa蛋白在防治线虫病中的应用，优选在防除水稻根尖线虫病中的应用。
8.权利要求1所述的Cry31Aa蛋白在制备防治线虫病的生物农药中的应用，优选在制备防除水稻根尖线虫病的生物药物中的应用。
9.权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5或6所述的基因工程菌在制备防治线虫病的生物农药中的应用，优选在制备防除水稻根尖线虫病的生物药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于利用权利要求5
...【技术特征摘要】
1.cry31aa蛋白，氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.权利要求1所述的cry31aa蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.含有权利要求2或3所述cry31aa蛋白的编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2或3所述cry31aa蛋白的编码基因的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
7.权利要求1所述的cry31aa蛋白在防治线虫病中的应用，优选在防...
【专利技术属性】
技术研发人员：高学文，梁昭，伍辉军，顾沁，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。