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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫化学,尤其涉及一种抗msh2重组兔单克隆抗体及其应用,特别是在免疫组织化学检测方面的应用。
技术介绍
1、错配修复系统(mismatch repair,mmr)是重要的dna修复机制,是识别和修复在dna复制或重组过程中,可能产生碱基的错误插入、缺失和错配以及修复某些形式的dna损伤的系统,防止基因突变以维持基因组稳定性。该系统由一系列特定的dna错配修复酶组成。mmr基因胚系检测是林奇综合征(lynch syndrome)诊断的“金标准”。lynch综合征的分子病因包括mmr基因家族中的mlh1、msh2、msh6或pms2基因上的杂合性致病突变,以及epcam基因缺失突变(该突变导致msh2启动子高度甲基化,引起msh2基因沉默)。由于mmr基因功能性失活,lynch综合征患者常常表现出msi-h和dmmr,因此msi检测和mmr蛋白ihc检测均可以作为初筛手段。
2、在免疫组化中,错配修复蛋白一般包括msh2、msh6、mlh1、pms2四项,一般联合应用于遗传性非息肉性肠癌(hnpcc)和伴有msi的肿瘤的筛查。其中msh2是一种分子量大小约为104kd的错配修复蛋白。mlh2可以与msh6形成异二聚体,msh2/msh6异二聚体负责通过构象变化与初始dna错配碱基结合,具有识别单个碱基的错配突变、短缺失、或插入突变等碱基错配的功能。该基因的突变会导致细胞错配修复功能缺陷,使微卫星不稳定(msi),从而导致肿瘤易感。
3、免疫组化(ihc)方法通过显微镜观察是否在细胞内正常表达,
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、本专利技术提出一种抗msh2重组兔单克隆抗体及其应用,其目的在于解决现有抗msh2重组兔单克隆抗体阳性信号弱,在ihc染色不利于识别的问题。
3、(二)技术方案
4、为了达到上述目的,本专利技术采用的主要技术方案包括:
5、第一方面,本专利技术提供一种抗msh2重组兔单克隆抗体,所述抗msh2重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区,
6、所述重链可变区为:如seq id no.4所示的氨基酸序列;或seq id no.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽;
7、所述轻链可变区为:如seq id no.5所示的氨基酸序列;或seq id no.5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。
8、第二方面,本专利技术提供编码所述的抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸。
9、优选地,所述核苷酸包括如seq id no.2所示的dna序列,用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的重链可变区;以及如seq id no.3所示的dna序列用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的轻链可变区。
10、第三方面,本专利技术涉及一种核酸分子,其包括用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸。
11、第四方面,本专利技术保护一种含有上述核酸分子的生物材料,所述生物材料为表达载体或重组质粒。
12、第五方面,本专利技术提供一种抗msh2重组兔单克隆抗体的制备方法,采用上述表达载体转染细胞,培养转染后的细胞,收集细胞上清液并纯化,得到所述抗msh2重组兔单克隆抗体。
13、更优选地,所述制备方法包括如下步骤:
14、(1)免疫兔子:先对msh2蛋白分子序列进行分析,依据msh2的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构,选择和使用合适的多肽序列作为免疫原,经由klh或ova偶联后作为免疫原,免疫兔子;所述多肽为seq id no.1所示的人工合成多肽;
15、(2)制备杂交瘤细胞系:经细胞融合、克隆筛选,获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞系,从杂交瘤细胞系中分离出总rna;
16、(3)获得抗体序列:利用特异性的引物,通过pcr扩增技术获得抗体重链可变区的核苷酸序列seq id no.2和抗体轻链可变区的核苷酸序列seq id no.3;
17、(4)抗体表达和纯化:将所述核苷酸序列克隆至表达载体中,使用转染方法瞬时转染培养的细胞,培养后收集上清,使用protein a纯化上清液,得到纯度>95%的抗体。
18、第六方面,所述的抗msh2重组兔单克隆抗体、核苷酸、核酸分子、表达载体或重组质粒在制备msh2蛋白分子检测装置中的应用。所述检测装置包括但不限于试剂盒、抗体芯片等。
19、第七方面,本专利技术还提供一种msh2检测试剂盒,其包括上述的抗msh2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。
20、优选地,所述msh2检测试剂盒还包括底物显色液、封闭液或修复液中的至少一种。
21、进一步优选的包括:抗msh2重组兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗(hrp酶标二抗)、edta修复液、过氧化氢酶封闭液、3,3-二氨基苯联胺浓缩液(dab浓缩液)、3,3-二氨基苯联胺缓冲液(dab缓冲液)、苏木素和返蓝液。
22、在进行免疫组织化检测时,检测步骤包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、3,3-二氨基苯联胺显色(dab显色)、复染、脱水、封片和镜检等。
23、(三)有益效果
24、本专利技术提供的抗msh2重组兔单克隆抗体,本专利技术还涉及编码该抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组质粒或表达载体、制备方法及抗msh2重组兔单克隆抗体在msh2蛋白检测方法或装置中的应用等。抗msh2重组兔单克隆抗体与msh2蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度,能够特异性地识别和检测细胞上msh2蛋白的表达,在检测msh2蛋白时呈阳性高表达,因此该抗体可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(westernblotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域,有利于获得准确的评估和检测结果。本专利技术的644g5a4克隆的msh2重组兔单克隆抗体由于其特异性好,阳性信号强等特点,在ihc染色中评分更容易,对于检测区分癌症更准确。可应用于免疫组织化学、间接elisa、免疫印记、抗体芯片制备等检测与筛查领域,有利于获得更准确的检测和评估结果,并降低检测成本和背景信号的干扰。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种抗MSH2重组兔单克隆抗体,其特征在于,所述抗MSH2重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区,
2.编码权利要求1所述的抗MSH2重组兔单克隆抗体的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核苷酸,其特征在于,所述核苷酸包括:如SEQ ID No.2所示的DNA序列,以用于编码所述抗MSH2重组兔单克隆抗体的重链可变区,以及如SEQ ID No.3所示的DNA序列,以用于编码所述抗MSH2重组兔单克隆抗体的轻链可变区。
4.一种核酸分子,其特征在于,其含有权利要求2或3所述的核苷酸。
5.含有权利要求4所述核酸分子的生物材料,其特征在于,所述生物材料为表达载体或重组质粒。
6.一种抗MSH2重组兔单克隆抗体的制备方法,其特征在于,其采用权利要求5所述的表达载体对细胞进行转染,转染后继续培养细胞,收集细胞上清液并纯化,得到所述抗MSH2重组兔单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
8.权利要求1所述的抗MSH2重组兔单克隆抗体、权利要求2或3所述核苷酸、权利要
9.一种MSH2检测试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1的抗MSH2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。
10.根据权利要求9所述的MSH2检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括底物显色液、封闭液或修复液中的至少一种。
...【技术特征摘要】
1.一种抗msh2重组兔单克隆抗体,其特征在于,所述抗msh2重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区,
2.编码权利要求1所述的抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核苷酸,其特征在于,所述核苷酸包括:如seq id no.2所示的dna序列,以用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的重链可变区,以及如seq id no.3所示的dna序列,以用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的轻链可变区。
4.一种核酸分子,其特征在于,其含有权利要求2或3所述的核苷酸。
5.含有权利要求4所述核酸分子的生物材料,其特征在于,所述生物材料为表达载体或重组质粒。
6.一种抗msh...
【专利技术属性】
技术研发人员:肖目张,徐志杰,何青春,刘杨,张东旭,
申请(专利权)人:苏州百道医疗科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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