本发明专利技术涉及一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。相比市售的抗CLDN 18.2单克隆抗体，本发明专利技术的抗CLDN 18.2单克隆抗体具有更高的亲和力，能够高特异性和高灵敏度地识别CLDN 18.2抗原蛋白和肿瘤细胞和免疫细胞上的CLDN 18.2分子。该抗体可应用于免疫组织化学、间接ELISA、免疫印记、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得更准确的评估和检测结果，且在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，以降低成本。以降低成本。以降低成本。
【技术实现步骤摘要】
一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体及其应用
[0001]本专利技术属于免疫化学
，尤其涉及一种抗 CLDN 18.2抗体及其应用，特别是在免疫组织化学检测方面的应用。
技术介绍
[0002]Claudins（CLDNS）家族蛋白在人体上皮组织中广泛分部，其在上皮细胞维持渗透压、屏障功能、细胞极性以及细胞紧密连接等方面发挥着重要作用。此外，研究表明，在多种肿瘤形成过程中，CLDNS表达模式会发生不同程度的改变。因此，其可作为靶向治疗标志蛋白用于肿瘤治疗研究。CLDN 18蛋白作为CLDNs家族一员，其由人CLDN18基因编码，拥有CLDN 18.1和CLDN 18.2两种剪切突变体。其中，CLDN 18.2是一种具有高度选择性的标志蛋白，仅有限度地表达于分化的胃黏膜上皮细胞，而在其余正常组织中表达高度受限。然而，在多种原发性和转移癌种，如胃癌，胰腺癌，食管癌和肺癌中，CLDN 18.2蛋白表达被异常激活。Claudin18.2的异常表达改变细胞原有的极性，并提供肿瘤细胞转移与生长的有利条件。同时，Claudin18.2蛋白表达于细胞膜表面。因此，Claudin18.2作为抗肿瘤潜在靶点具有极大的应用前景。
[0003]目前，数款以Claudin18 .2为靶点的抗肿瘤药物进入临床研究阶段，但如何评估恶性肿瘤中Claudin18 .2的表达水平仍无有效的检测手段。免疫组织化学检测是通过酶标抗体的显色反应来确定靶标蛋白位置和表达强度，是检测肿瘤中CLDN 18.2表达水平的有效手段，而CLDN 18.2抗体的质量直接影响最终的显色结果。因此，获得一株高灵敏度、强特异性的抗 CLDN 18.2抗体对CLDN 18.2表达水平的检测具有非常重要的意义。
技术实现思路
[0004]（一）要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，其与Claudin18.2蛋白的结合具有高特异性和灵敏度，可用于免疫组织化学检测，从而准确评估恶性肿瘤中Claudin18 .2的表达水平。本专利技术还涉及编码该抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组质粒、制备方法及抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体在Claudin18.2蛋白的检测方法或装置中的应用等。
[0005]（二）技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：第一方面，本专利技术提供一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0006]第二方面，本专利技术提供编码基因，用于编码上述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。
[0007]优选地，所述编码基因包括如SEQ ID No.4所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的重链可变区的DNA序列，以及如SEQ ID No.5所示的用于编码所述抗
CLDN18.2重组兔单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列。
[0008]第三方面，本专利技术涉及一种核酸分子，其包括用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的编码基因。
[0009]第四方面，本专利技术保护一种表达载体，其包括上述的核酸分子。
[0010]第五方面，本专利技术提供一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的制备方法，采用上述表达载体转染细胞，培养转染后的细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。
[0011]更优选地，所述制备方法包括如下步骤：（1）免疫兔子：先对 CLDN 18.2分子序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择和使用合适的多肽序列作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后作为免疫原免疫兔子；所述多肽为SEQ ID No.1
‑
3所示的人工合成多肽；（2）制备杂交瘤细胞系：经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞系，从杂交瘤细胞系中分离出总RNA；（3）获得抗体序列：利用特异性的引物，通过PCR扩增技术获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列；（4）抗体表达和纯化：将所述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染方法瞬时转染培养的293细胞，培养后收集上清，使用Protein A纯化上清液，得到纯度＞95％的抗体。
[0012]第六方面，所述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体、编码基因、核酸分子、表达载体在制备CLDN18.2检测装置中的应用。所述检测装置包括但不限于试剂盒、抗体芯片等。
[0013]第七方面，本专利技术还提供一种CLDN18.2检测试剂盒，其包括上述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。
[0014]优选地，所述CLDN18.2检测试剂盒包括：抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体、HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素、返蓝液。
[0015]在进行免疫组织化检测时，检测步骤包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、复染、脱水、封片和镜检等。
[0016]（三）有益效果本专利技术提供的抗 CLDN 18.2单克隆抗体，与Claudin18.2蛋白的结合具有高特异性和高灵敏度，能够特异性地识别CLDN 18.2抗原蛋白和肿瘤细胞和免疫细胞上的 CLDN 18.2分子，在检测Claudin18.2蛋白时呈阳性高表达，因此该抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得更准确的评估和检测结果，同时在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，以降低生产成本，还可在保证灵敏度的情况下降低背景，使病理医生进行主观评判时更加方便，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。
附图说明
[0017]图1为本专利技术制备的抗 CLDN 18.2单克隆抗体与市售 CLDN 18.2单克隆抗体在胃癌的免疫组化检测代表性结果比对图，一抗使用浓度为1μg/mL。
[0018]图2为本专利技术的451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体与市售CLDN 18.2单克隆抗体在7个梯度浓度下效价检测的统计图。
[0019]图3为向表达CLDN18.2蛋白的细胞中加入等量的市售抗 CLDN 18.2抗体与451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体后进行流式细胞术染色分析，得到的空白对照、市售抗 CLDN 18.2抗体样品、451I3V0抗 CLDN 18.2单抗样品三者的荧光信号强度（MFI）对比图。
具体实施方式
[0020]为进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本专利技术作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术的限定。
[0021]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。2.编码基因，其特征在于，用于编码权利要求1所述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其包括：如SEQ ID No.4所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的重链可变区的DNA序列，以及如SEQ ID No.5所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列。4.一种核酸分子，其特征在于，其包括权利要求2或3所述的编码基因。5.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求4所述的核酸分子。6.一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其采用权利要求5所述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫兔子：先对 CLDN 18.2分子序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择和使用合适...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟凡华，程育苗，刘杨，张东旭，李静，
申请(专利权)人：苏州百道医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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