一种抗鸡TLR15蛋白的多克隆抗体及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体及其制备方法，包括鸡TLR15蛋白的抗原性分析、筛选用于制备抗体的肽段对应基因序列、密码子优化及基因合成、原核表达及免疫。鸡Toll样受体15（chTLR15）是一种禽类特有的细胞表面模式识别受体，介导的先天性免疫反应对禽类抵御细菌以及病毒入侵具有重要作用，但由于其商业化抗体的缺乏，其配体和激活机制不清。本发明专利技术通过分析chTLR15蛋白的抗原性，密码子优化及基因合成和原核表达，获得重组蛋白His

【技术实现步骤摘要】
一种抗鸡TLR15蛋白的多克隆抗体及制备方法


[0001]本专利技术涉及一种抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体及其制备
，特别是涉及一种鸡TLR15（Toll
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like receptors 15，TLR15）部分基因片段的选择、密码子优化及合成，重组质粒的构建，重组蛋白表达、纯化，多克隆抗体的制备及特异性检测。

技术介绍

[0002]chTLR15是鸡TLRs家族中特有的先天免疫受体蛋白。chTLR15以同源二聚体形式存在，具有抵抗细菌入侵、激活机体抗病毒能力。chTLR15属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是禽类体内一类重要的模式识别受体，广泛存在于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑及胸腺等组织中，其中在法氏囊中mRNA转录水平最高，其次是脾脏与盲肠。chTLR15的激活涉及受体胞外域的蛋白水解切割与NF
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κB依赖性基因转录的刺激，且chTLR15可识别病毒非甲基化CpG
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DNA序列，激活机体抗病毒能力。
[0003]目前chTLR15的研究集中在chTLR15介导的先天性免疫反应对禽类抵御细菌以及病毒入侵的研究；通过高效识别病毒肽聚糖，激活并产生IL
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1β炎性因子；chTLR15相关信号通路对宿主抗感染免疫应答的研究。
[0004]人、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物以及家禽，果蝇的TLRs已鉴定并证实，但TLR15为鸡特有的先天免疫受体蛋白，对chTLR15研究尚不深入，尤其是还未出现商业化鸡TLR15多克隆抗体。
[0005]在本次专利技术中，根据NCBI公布的鸡TLR15序列，分析其抗原性，选定76
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681bp基因序列（长606bp）所编码的第25
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227 aa（长202aa）作为抗原，对76
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681bp基因序列进行密码子优化后，合成基因片段，利用原核表达系统表达pET30
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chTRL15，通过纯化浓缩chTRL15重组蛋白制备兔抗TLR15血清多抗。本专利技术填补了缺乏商品化chTLR15抗体的空白，为TLR15在家禽方面的研究提供了基础资料。

技术实现思路

[0006]本专利技术克服了抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体制备技术的缺陷，提供一种编码鸡TLR15蛋白片段的核苷酸序列优化序列、重组蛋白表达及纯化、多克隆抗体制备及抗体特异性检测方法。
[0007]本专利技术的目的是提供一种抗鸡TLR15蛋白的多克隆抗体，以解决现有技术中针对鸡TLR15蛋白缺少特异性抗体的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体由经重组质粒pET30a
‑
chTLR15编码表达的重组蛋白经生物免疫制得，所述重组质粒pET30a
‑
chTLR15中TLR15基因序列为SEQ ID NO.3所示，由SEQ ID NO.1核苷酸序列经密码子优化而来，该序列长606bp，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该序列编码202个氨基酸（第25
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227位），分子量预测为22kDa，等电点为5.74，预测融合His标签后蛋白分子量为27kDa。
[0009]本专利技术进一步公开了抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体制备方法包括以下步骤：步骤一：鸡TLR15抗原性分析、密码子优化及基因片段的合成；步骤二：构建原核表达载体pET30a
‑
chTLR15；步骤三：使用重组质粒对感受态大肠杆菌进行转化，制备工程菌；步骤四：诱导工程菌进行重组蛋白的表达，并进行纯化；步骤五：使用重组蛋白对家兔进行免疫，制备多克隆抗体。
[0010]其中所述步骤一中鸡TLR15抗原性分析及基因片段合成方法如下：分析NCBI上公布的chTLR15序列，选取抗原性强的片段606bp（76
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681 bp），密码子优化后，两端加入EcoRⅠ、XhoI酶切位点，合成基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]步骤二中构建重组载体的步骤如下：用EcoRⅠ、XhoI分别酶切pET30载体和chTLR15基因合成片段，切胶回收片段，连接，获得重组质粒pET30a
‑
chTLR15。
[0012]步骤三制备工程菌的步骤如下：将重组质粒pET30a
‑
chTLR15，转化BL21感受态细胞，构建带有重组质粒的工程菌。
[0013]步骤四中chTLR15重组蛋白表达纯化的步骤如下：经IPTG诱导表达，去离子水洗镍柱纯化获得chTLR15重组蛋白。
[0014]步骤五中制备多克隆抗体的方法如下：chTLR15重组蛋白免疫新西兰大白兔，接种方式为背部皮下多点注射，首免使用弗氏完全佐剂，分别于第二周，第四周，第五周使用弗氏不完全佐剂进行一免，二免，三免，于加强免疫后7天取兔血清，得到抗chTLR15蛋白多克隆抗体。
[0015]本专利技术同时也公开了抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体在用于特异性检测鸡TLR15蛋白方面的应用；所述的多克隆抗体特异性检测指的是：抗鸡TLR15蛋白抗体识别鸡TLR15蛋白的检测。实验结果显示抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体可特异性识别DF
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1细胞及鸡法氏囊和胸腺组织中的鸡TLR15蛋白。
[0016]本专利技术还进一步公开了多克隆抗体的特异性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：蛋白样品的获得：DF
‑
1细胞在37℃、5%CO2培养箱内培养至70%左右，提取DF
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1细胞蛋白；取鸡法氏囊与胸腺组织100mg左右，加入蛋白裂解液1mL，冷冻研磨仪研磨混匀。
[0017]特异性检测：将提取的蛋白经SDS
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PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜上，转印条件为恒流110V，85min。用快速封闭液室温封闭1h，TBST洗涤2次；β
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actin（1:1000）和chTLR15多克隆抗体血清（1:1000）作为一抗，4℃过夜孵育，TBST洗涤3次，每次5min；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG（1:1000）和辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG（1:1000）作为二抗，常温孵育90min，TBST洗涤3次，每次5min；用发光液曝光。观察特异性结果。
[0018]本专利技术更加详细的描述如下：（1）一种抗原性强的鸡TLR15蛋白片段，其氨基酸序列如（SEQ ID NO.2）所示。
[0019]（2）一种编码上述基因的核苷酸序列如（SEQ ID NO.1）所示。
[0020]（3）一种基于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经密码子优化后更适于原核表达的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0021]（4）一种构建鸡TLR15重组载体的制备方法，包括以下步骤：
分别用EcoRⅠ、XhoI酶切pET30载体和合成的chTLR15部分基因序列，切胶回本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体由经重组质粒pET30a
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chTLR15编码表达的重组蛋白经生物免疫制得，所述重组质粒pET30a
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chTLR15中TLR15基因序列为SEQ ID NO.3所示，由SEQ ID NO.1核苷酸序列经密码子优化而来，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体制备方法包括以下步骤：步骤一：鸡TLR15抗原性分析、密码子优化及基因片段的合成；步骤二：构建原核表达载体pET30a
‑
chTLR15；步骤三：使用重组质粒对感受态大肠杆菌进行转化，制备工程菌；步骤四：诱导工程菌进行重组蛋白的表达，并进行纯化；步骤五：使用重组蛋白对家兔进行免疫，制备多克隆抗体。3.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤一中鸡TLR15抗原性分析及基因片段合成方法如下：分析NCBI上公布的chTLR15序列，选取抗原性强的片段606bp（76
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681 bp），密码子优化后，两端加入EcoRⅠ、XhoI酶切位点，合成基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤二中构建重组载体的步骤如下：用EcoRⅠ、XhoI分别酶切pET30载体和chTLR15基因合成片段，切胶回收片段，连接，获得重组质粒pET30a
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chTLR15。5.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，在步骤三制备工程菌的步骤如下：将重组质粒pET30a
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chTLR15，转化BL21感受态细胞，构建带有重组质粒的工程菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓雪，潘鹏宇，李留安，孙英峰，尤春雪，张文娟，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：