【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种山药dppds基因的vigs沉默体系及其应用。
技术介绍
1、山药（dioscorea spp.）是薯蓣科（dioscoreaceae）薯蓣属（dioscorea）中能形成地下肉质块茎的草质藤本植物。山药遗传变异广泛，种质资源丰富，我国是山药的重要起源和驯化中心之一，以薯蓣种山药（d. polystachya turczaninow）普遍栽培。山药具有独特的营养价值和多重保健功效，由传统的旱粮转变为粮、菜、食品加工原料广泛用途的高效作物，具良好市场前景和产业开发潜能。因此，研究山药代谢调控、抗病、抗逆等相关基因功能对山药遗传改良具有重要作用。
2、八羟番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase, pds）是植物类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，沉默该基因可导致植株白化表型。目前，有关山药八羟番茄红素脱氢酶基因的研究较少，选择山药八羟番茄红素脱氢酶的基因片段，沉默山药dppds基因，研究山药dppds基因的相关功能尤为重要。
3、病毒介导的基因沉默技术（virus-induced gene silencing, vigs），是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默，出现相应的表型变化。vigs技术在当代植物上直接产生rnai效果，大幅度节约时间和成本，可同时实现多个基因的沉默，避免传统转基因体系的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物和受基因型限制的品种，因而在植物基因功能的研究中应用越来越广泛。然而，在对基因进行沉默时，基因片段的选择尤为重要，片段
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种沉默山药dppds基因的基因片段，构建山药dppds基因的vigs沉默体系，提高山药dppds基因的沉默效果，进而研究山药基因的相关功能。
2、本专利技术提供了一种沉默山药dppds基因的基因片段，所述基因片段包括如seq idno.1所示的核苷酸序列或如seq id no.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。
3、本专利技术还提供了一种沉默山药dppds基因的重组表达载体，所述重组表达载体包括vigs病毒载体和插入所述vigs病毒载体的基因片段；
4、所述基因片段为上述技术方案所述的基因片段。
5、优选的，所述vigs病毒载体为烟草脆裂病毒trv2载体。
6、本专利技术还提供了上述技术方案所述的基因片段或重组表达载体在制备山药dppds基因vigs沉默体系中的应用。
7、本专利技术还提供了一种山药dppds基因的vigs沉默体系，所述vigs沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有上述技术方案所述重组表达载体的农杆菌菌液。
8、优选的，农杆菌为农杆菌gv3101或农杆菌lba4404；
9、所述辅助载体为烟草脆裂病毒trv1载体。
10、本专利技术还提供了一种上述技术方案所述的vigs沉默体系的构建方法，包括如下步骤：
11、提取山药rna，反转录获得山药cdna；
12、利用上游引物dppds-xba i-f和下游引物dppds-bam hi-r对所述山药cdna进行pcr扩增，获得山药dppds基因的干扰片段；
13、将所述干扰片段插入vigs病毒载体，得到含有山药dppds基因的重组质粒，转化农杆菌，得到含有重组表达载体的农杆菌菌液；
14、所述上游引物dppds-xba i-f的核苷酸序列如seq id no.2所示；
15、所述下游引物dppds-bam hi-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；
16、将辅助载体转化农杆菌，得到含有辅助载体的农杆菌菌液；
17、将所述含有重组表达载体的农杆菌菌液和含有辅助载体的农杆菌菌液混合，黑暗静置4~6h，得到所述vigs沉默体系。
18、本专利技术还提供了上述技术方案所述的基因片段或重组表达载体或vigs沉默体系在鉴定山药基因功能中的应用。
19、本专利技术还提供了一种沉默山药dppds基因的方法，包括如下步骤：
20、利用上述技术方案所述的vigs沉默体系对山药珠芽进行真空渗透侵染。
21、优选的，所述真空渗透侵染还包括：播种真空渗透侵染后的山药珠芽，培养成苗。
22、有益效果：
23、本专利技术提供了一种沉默山药dppds基因的基因片段，所述基因片段包括如seq idno.1所示的核苷酸序列或如seq id no.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。本专利技术提供的基因片段可以干扰山药内源的dppds基因表达，使植株内源dppds基因发生沉默，相比空白对照，山药内源的dppds基因的相对表达量降低66.7%~88.23%，能够用于鉴定该内源目的基因的功能。
24、山药存在遗传转化难度大、生长周期长的问题，严重阻碍山药基因的深入研究，在以上述基因片段作为干扰片段的基础上构建vigs沉默体系，借助真空渗透法瞬时转化山药珠芽，trv1可以激活trv2在植株内的扩散，在使山药内源目的基因发生沉默的同时，克服了山药遗传转化周期长、难度大等困难。
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1.一种沉默山药DpPDS基因的基因片段，其特征在于，所述基因片段包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。
2.一种沉默山药DpPDS基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括VIGS病毒载体和插入所述VIGS病毒载体的基因片段；
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述VIGS病毒载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。
4.权利要求1所述的基因片段或权利要求2或3所述的重组表达载体在制备山药DpPDS基因VIGS沉默体系中的应用。
5.一种山药DpPDS基因的VIGS沉默体系，其特征在于，所述VIGS沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有权利要求2或3所述的重组表达载体的农杆菌菌液。
6.根据权利要求5所述的VIGS沉默体系，其特征在于，农杆菌为农杆菌GV3101或农杆菌LBA4404；
7.一种权利要求5或6所述的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.权利要求1所述的基因片段或权利要求2或3
9.一种沉默山药DpPDS基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述真空渗透侵染还包括：播种真空渗透侵染后的山药珠芽，培养成苗。
...【技术特征摘要】
1.一种沉默山药dppds基因的基因片段，其特征在于，所述基因片段包括如seq idno.1所示的核苷酸序列或如seq id no.1所示的核苷酸序列的反向互补序列。
2.一种沉默山药dppds基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括vigs病毒载体和插入所述vigs病毒载体的基因片段；
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述vigs病毒载体为烟草脆裂病毒trv2载体。
4.权利要求1所述的基因片段或权利要求2或3所述的重组表达载体在制备山药dppds基因vigs沉默体系中的应用。
5.一种山药dppds基因的vigs沉默体系，其特征在于，所述vigs沉默体系包括含有辅助载体的农杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：单楠，周庆红，黄英金，王葡萄，孙静宇，肖遥，罗莎，汪生林，林佳丽，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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