腺病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及重组腺病毒载体、其免疫原性组合物及其在医药中的用途。特别地，本发明专利技术提供一种包含除AdHu5和AdY25之外的腺病毒的基因组的腺病毒载体，其中已对腺病毒的基因组进行修饰，使得所述载体缺乏所述腺病毒的天然E4基因座并且包含来自AdY25的异源性的E4Orf1、E4Orf2和E4Orf3编码区。

Adenovirus vector

The present invention relates to recombinant adenovirus vector, its immunogenic composition and its application in medicine. In particular, the present invention provides an adenoviral vector containing the genome of adenoviruses other than AdHu5 and AdY25, in which the genome of the adenovirus has been modified so that the vector lacks the natural E4 locus of the adenovirus and contains the heterologous E4Orf1, E4Orf2 and E4Orf3 coding regions from AdY25.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺病毒载体本专利技术涉及新的腺病毒载体、其免疫原性组合物及其在医药中的用途。本文中引用的全部出版物、专利和专利申请均通过引用的方式全文纳入本文中。专利技术背景传统上，疫苗是基于完全灭活或减毒的病原体。然而，对于许多传染性疾病如疟疾，这种方法是不切实际的，并且研究焦点已经转移到“亚单位疫苗(subunitvaccines)”的开发上，所述亚单位疫苗仅表达那些诱导与保护相关的免疫的源于病原体的抗原。亚单位疫苗向免疫系统提供抗原，而不引起完全感染的生物体。一种这样的方法涉及给予来自感染性生物体的特异性的分离蛋白。然而，该技术通常仅诱导弱的免疫应答，并且分离蛋白可能具有不同于所述蛋白在其正常环境中所具有的三维结构，导致产生可能无法识别感染性生物体的抗体。因此，已经开发了一种替代方法，其利用病毒载体来递送抗原。病毒是专性的细胞内寄生物，其通过将其DNA转染到宿主细胞中并诱导宿主细胞表达病毒基因组而复制。已经利用这种繁殖策略通过创建携带一种或更多种异源转基因的重组非复制型病毒载体来创建载体疫苗。将重组病毒基因组转染或转导到宿主细胞中会导致异源转基因在宿主细胞中表达。例如，当异源转基因编码抗原时，抗原在宿主细胞内的表达可引起宿主免疫系统的保护性或治疗性的免疫应答。病毒载体本身可起到有效疫苗的作用。或者，异源转基因可编码基因的功能等位基因，其表达可用于在称为基因治疗的过程中抵消所述基因的有害的突变等位基因的作用。腺病毒特别适于用作病毒载体。腺病毒是无包膜病毒，直径约90-100nm，包含核衣壳和线性双链DNA基因组。病毒核衣壳包含五邻体衣壳体和六邻体衣壳体。一种独特的纤维与各五邻体基质相关，并且帮助病毒经由宿主细胞表面的柯萨奇病毒-腺病毒受体而附着到宿主细胞上。已识别出超过50种的腺病毒血清型菌株，其中大多数引起人类的呼吸道感染、结膜炎和胃肠炎。腺病毒通常作为宿主细胞核中的游离基因成分复制，而不是整合到宿主基因组中。腺病毒的基因组包含4个早期转录单位(E1、E2、E3和E4)，其主要具有调节功能，并为宿主细胞复制病毒作准备。基因组还包含5个晚期转录单位(L1、L2、L3、L4和L5)，其转录包括五邻体(L2)、六邻体(L3)、支架蛋白(L4)和纤维蛋白(L5)在内的结构蛋白，其中结构蛋白受单个启动子的控制。基因组的每一末端都包含病毒复制所必需的末端反向重复(ITR)序列。最初开发重组腺病毒是用于基因治疗的，但由这些基因递送剂引发的强而持久的转基因特异性免疫应答促使了将其用作疫苗载体。除了具有高免疫原性外，腺病毒还为临床疫苗开发提供了许多其他优势。腺病毒的基因组相对较小(在26和45kbp之间)、表征良好且易于操纵。单个转录单位E1的缺失使得病毒复制不能进行，这提高了其在临床应用中的可预测性并减少了副作用。重组腺病毒可容纳相对较大的转基因，在一些情况下可达8kb，允许灵活地设计亚单位，并且具有相对较宽的向性，促进转基因递送至各种细胞和组织。已经很好地建立了具有重要临床应用价值的重组腺病毒的大规模生产和高滴度纯化的方法。迄今为止，已将亚组C血清型AdHu2或AdHu5主要用作载体。然而，尽管临床前的数据1令人鼓舞，但基于原型人体腺病毒AdHu5的第一代疫苗载体在临床试验中效果不佳。随后，发现由于自然感染，大部分成年人对常见的人血清型如AdHu2和AdHu5具有显著滴度的中和抗体。中和抗体可以通过阻断病毒进入宿主细胞并由此递送目标转基因来降低病毒载体疫苗的效力。正在通过开发基于人群不太可能已经暴露的血清型(包括黑猩猩来源2，3的那些)的新的腺病毒载体来解决预先存在的抗载体免疫力的发生。然而，一些此类黑猩猩腺病毒载体由于人群中无法解释的免疫力、与人腺病毒的交叉反应性水平不同以及转化细胞系中的次优生长而具有有限的功效。此外，由于诱导对抗载体的中和抗体可避免针对另一种适应症而再次给予载体，因此，具有一系列的可用于针对不同疾病引发免疫的不同的腺病毒载体是有利的。WO2012/172277描述了源自黑猩猩腺病毒AdY25的腺病毒载体，其解决了本领域的上述问题中的一些问题。所述载体称为ChAdOx1。然而，本领域中仍然需要高度免疫原性的非人腺病毒载体，其有效地递送目标转基因、最小化预先存在的对腺病毒血清型的免疫力并在转化细胞系中有效地复制。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供一种包含除AdHu5和AdY25之外的腺病毒的基因组的腺病毒载体，其中已经对腺病毒的基因组进行修饰，使所述载体缺乏腺病毒的天然E4基因座，并且包含来自AdY25的异源性的E4Orf1、E4Orf2和E4Orf3编码区。在一个优选的实施方案中，腺病毒的E4基因座中还包含来自AdHu5的异源性的E4Orf4、E4Orf6和E4Orf6/7编码区。在一个优选的实施方案中，所述腺病毒为C68。在一个优选的实施方案中，所述腺病毒缺乏功能性的E1基因座和/或缺乏E3基因座。在第二方面，本专利技术提供一种包含本专利技术第一方面的腺病毒载体和任选地一种或更多种其他活性成分、药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂的免疫原性组合物。优选地，佐剂是水包油佐剂。例如，佐剂可包含鲨烯。优选地，佐剂选自AS03、AF03或Addavax。第三方面提供第一方面的腺病毒载体或第二方面的免疫原性组合物在医药中的用途。特别地，提供腺病毒载体和免疫原性组合物用于将转基因递送到宿主细胞中、引发动物中的免疫应答、增强动物中的免疫应答、治疗或预防至少一种疾病、诱导动物中会破坏对自体抗原和基因治疗耐受性的免疫应答。第四方面提供一种编码本专利技术第一方面的腺病毒载体的多核苷酸序列。本专利技术第五方面提供一种用本专利技术第一方面病毒载体转导的宿主细胞。本专利技术第六方面提供一种通过将第四方面的多核苷酸序列整合到细菌人工染色体(BAC)中来生产本专利技术第一方面的病毒载体的方法。本专利技术第七方面提供一种包含本专利技术第四方面的多核苷酸序列的细菌人工染色体(BAC)克隆。本专利技术第八方面提供生产本专利技术第一方面的病毒载体的包装细胞系。附图说明参考以下各图对本专利技术进行说明：图1：黑猩猩腺病毒68(ChAd68)的分子克隆的产生。a)通过缺口修复将ChAd68基因组DNA插入到pBAC“拯救载体(rescuevector)”中。从Chad68基因组DNA扩增E1左侧翼区域1(LF1)和2(LF2)以及末端右侧区域(RF)，并将它们克隆到pBACe3.6中以产生BAC腺病毒拯救克隆。在分离的ChAd68基因组的LF1和LF2与BAC拯救克隆之间以及ChAd68基因组的RF和BAC拯救克隆之间发生了重组。所得产物是含有缺失E1的ChAd68基因组的BAC。b)通过重组工程切除ChAd68的E3区域。首先，使用含有与E3(E3LF和E3RF)的侧翼区域同源的序列的引物从pGalK扩增半乳糖激酶基因(GalK)。使用λred重组用GalK基因替代E3区域。随后再次使用λred重组用由E3LF和E3RF组成的PCR产物替代GalK基因。所得产物是含有缺失E1E3的ChAd68基因组的BAC。c)在E1基因座处插入抗原盒。首先，使用含有与E1(LF1和LF2)的侧翼区域同源的序列的引物从pGalK扩增半乳糖激酶基因(GalK)。使用λred重组用GalK基因替代E1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺病毒载体，其包含除AdHu5和AdY25之外的腺病毒的基因组，其中已对腺病毒的基因组进行修饰，使得所述载体缺乏腺病毒的天然E4基因座并且包含来自AdY25的异源性的E4Orf1、E4Orf2和E4Orf3编码区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.23 GB 1610967.01.一种腺病毒载体，其包含除AdHu5和AdY25之外的腺病毒的基因组，其中已对腺病毒的基因组进行修饰，使得所述载体缺乏腺病毒的天然E4基因座并且包含来自AdY25的异源性的E4Orf1、E4Orf2和E4Orf3编码区。2.权利要求1的腺病毒载体，在所述腺病毒的E4基因座中还包含来自AdHu5的异源性的E4Orf4、E4Orf6和E4Orf6/7编码区。3.权利要求1或2的腺病毒载体，其中所述腺病毒是C68。4.权利要求1至3中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体缺乏功能性的E1基因座。5.权利要求1至4中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体缺乏E3基因座。6.权利要求1至5中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体包含一种或更多种选自以下的衣壳蛋白：(a)由对应于SEQIDNO.1的核苷酸18315至21116的编码序列或与其基本相同的序列编码的六邻体蛋白；(b)由对应于SEQIDNO.1的核苷酸13884至15488的编码序列或与其基本相同的序列编码的五邻体蛋白；和(c)由对应于SEQIDNO.1的核苷酸32134至33411的编码序列或与其基本相同的序列编码的纤维蛋白。7.权利要求1至6中任一项的腺病毒载体，还包含编码蛋白质或多肽的目标外源性核苷酸序列。8.权利要求7的腺病毒载体，其中所述蛋白质或多肽选自抗原、分子佐剂、免疫刺激蛋白或重组酶。9.权利要求8的腺病毒载体，其中所述抗原为源于病原体的抗原。10.权利要求9的腺病毒载体，其中所述病原体选自结核分枝杆菌、疟原虫属种、流感病毒、HIV、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、寨卡病毒、利什曼虫寄生虫或分枝杆菌属种。11.权利要求10的腺病毒载体，其中所述抗原来自禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)。12.权利要求10的腺病毒载体，其中所述抗原是狂犬病病毒糖蛋白。13.权利要求7的腺病毒载体，其中所述目标外源性核苷酸序列是miRNA或免疫刺激性的RNA序列。14.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项的腺病...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·C·吉尔伯特，A·维艾斯·希尔，M·G·科廷厄姆，M·迪克斯，S·J·莫里斯，A·道格拉斯，
申请(专利权)人：牛津大学创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB