遗传擦除子制造技术

在一些实施方式中，本文提供了能够从工程化细胞除去异源核酸的方法、组合物、系统和试剂盒。

Hereditary eraser

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】遗传擦除子相关申请依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2016年7月26日提交的美国临时申请号62/366,755的权益，将其全部按引用并入本文中。
技术实现思路
在一些实施方式中，本文提供了用于从工程化细胞(例如，细胞疗法中使用的)高效地除去异源核酸(例如，DNA)的方法、组合物、系统和试剂盒。这种技术对于建立、工程化、制造和部署下一代人细胞疗法是明显变革性的。工程化(合成/人造)遗传(基因)回路通常可用于，例如，细胞疗法的离体分化和制造。携带使得能够动态控制细胞功能的工程化遗传回路(异源遗传回路)的细胞可以作为用于治疗/预防许多不同病症的治疗剂用于患者中。然而，一旦形成所需的细胞类型并运用于患者中，该工程化回路可能不是治疗应用必需的，而且甚至可能具有副作用。在这些遗传回路(例如，异源DNA盒)运用于患者后有效除去的能力对于患者安全性是有用的。例如，干细胞分化成胰腺β-岛细胞可以通过遗传回路来增强3，但一旦将β-岛细胞引入患者中，遗传回路的去除将减少监管和安全性顾虑。如本文中提供的多层平台(其在一些实施方式中结合了几种遗传切除和/或降解技术)经工程化用于有效去除(“擦除”)异源核酸(例如，DNA)。因此，本公开的工程化遗传构建体可以称为“遗传擦除子(geneticeraser)”。本公开的方面提供了包含表达盒(盒(cassette))的工程化遗传构建体(遗传擦除子)，所述表达盒包含(a)编码第一目标产物(例如，重组酶或核酸酶)的核苷酸序列，和(b)编码第二目标产物(例如，治疗性分子)和反选标记(例如，前药)的核苷酸序列，其中第一目标产物的表达或活性是可激活的，并且其中第一目标产物调节盒的切除或降解。在一些实施方式中，组分(A)在组分(b)的上游。在一些实施方式中，所述工程化遗传构建体(遗传擦除子)包含表达盒(盒)，所述表达盒包含(a)编码重组酶的核苷酸序列，(b)编码核酸酶的核苷酸序列，和(b)编码目标产物(例如，治疗性分子)和反选标记(例如，前药)的核苷酸序列，其中所述重组酶和核酸酶是可激活的并且调节盒的切除和/或降解。在一些实施方式中，所述工程化遗传构建体(遗传擦除子)包含盒，所述盒包含(a)可操作地连接于编码重组酶的核苷酸序列的诱导型启动子，和(b)可操作地连接于编码目标产物和反选标记的核苷酸序列的启动子，其中所述盒侧翼为同源重组酶识别位点。在一些实施方式中，所述工程化遗传构建体(遗传擦除子)包含盒，所述盒包含(a)可操作地连接于编码核酸酶的核苷酸序列的诱导型启动子，和(b)可操作地连接于编码目标产物和反选标记的核苷酸序列的启动子，其中所述盒侧翼为核酸酶识别位点。在一些实施方式中，所述工程化遗传构建体(遗传擦除子)包含盒，所述盒包含(a)可操作地连接于编码重组酶的核苷酸序列的诱导型启动子，(b)可操作地连接于编码核酸酶的核苷酸序列的诱导型启动子，和(c)可操作地连接于编码目标产物和反选标记的核苷酸序列的启动子，其中所述盒侧翼为同源重组酶识别位点并且包括同源核酸酶识别位点。本公开的一些方面提供了包括将本文中所述的任一种工程化遗传构建体引入细胞中的方法，其中所述目标产物有助于细胞的分化、扩增或表型维持。本公开的其他方面提供了包括将本文中所述的任一种工程化遗传构建体引入细胞中的方法，其中所述目标产物是治疗性分子和/或预防性分子。本公开还提供了包含本文中所述的任一种工程化遗传构建体的载体、细胞、组合物和试剂盒。附图说明图1显示了怎样利用多重冗余和正交重组酶蛋白从靶细胞切除异源DNA构建体的实例。这些重组酶通过诱导转录、分裂蛋白(splitprotein)活性的重建或蛋白质至核酸酶的易位来控制。图2A-2B显示了怎样使用核酸酶来靶向DNA用于破坏(图2A)和/或引发重组(图2B)来切除位于核酸酶靶位点(NTS)之间的大DNA片段的实例。这些核酸酶可以包括大范围核酸酶(meganuclease)、CRISPR-Cas核酸酶、锌指核酸酶和TALE核酸酶。核酸酶诱导的双链断裂可以导致灭活所靶向的蛋白质编码序列或催化大的缺失的重组，这可以通过供体DNA的存在来进一步增强。图3显示了异源DNA构建体中编码的反选标记(CSM)的实例，使得没有经历使用基于重组酶或基于核酸酶的途径的有效DNA切除的细胞在添加转化成毒性药物的前药时被杀灭。此外，编码了诱导性杀灭开关(killswitch)，其在添加表达毒素或将分裂的毒素二聚化的小分子诱导剂时引发细胞死亡。这些CSM将结合遗传擦除子来使用以增强异源DNA删除的效率。图4显示了用于稳定整合的基于重组酶的切除构建体的实例。这个模块构建体使得能够通过用限制酶的不同组合简单消化载体来容易地交换遗传部分。图5显示了测定重组酶切除效率的系统的实例。报告载体编码侧翼为反选标记(例如，HSV胸苷激酶)的重组序列。DNA装配可以使用多步法进行，包括，例如，限制性酶克隆、Gibson装配和GoldenGate装配。重组酶载体编码重组酶(例如，Bxb1)。图6显示了来自测试各种酪氨酸重组酶的重组酶活性的瞬时293FT细胞转染分析的数据。293FT细胞用等比率的报告质粒、重组酶质粒和转染标记质粒(例如，编码BFP的质粒)瞬时转染。分析细胞在转染后24小时的GFP荧光并且针对BFP表达进行门控。上图表示GFP+细胞％，而下图表示GFP+细胞的GFP平均荧光强度的中值。各个条的组从左到右显示对于报告子、重组酶和报告子+重组酶的数据。图7显示了来自测试各种酪氨酸重组酶的重组酶活性的瞬时293FT细胞转染分析的数据。293FT细胞用等比率的报告质粒、重组酶质粒和转染标记质粒(例如，编码BFP的质粒)瞬时转染。分析细胞在转染后24小时的GFP荧光并且针对BFP表达进行门控。柱状图表示具有和不具有重组酶的转染的细胞群体。图8显示了用于分析重组酶切除效率的系统的实例。BpiI(x2)-HSVtk-SV40pA-EGFP-Esp3I(x2)盒插入pcDNA3.1(+)哺乳动物表达载体(LifeTech)中。重组序列通过GoldenGate消化/连接插入BpiI和Esp3I位点中。图9显示了来自测试各种丝氨酸整合酶的重组酶活性的瞬时293FT细胞转染分析的数据。用等比率的报告质粒、重组酶质粒和转染标记质粒(例如，编码BFP的质粒)瞬时转染293FT细胞。分析细胞在转染后24小时的GFP荧光并且针对BFP表达进行门控。上图表示GFP+细胞％，而下图表示GFP+细胞的GFP平均荧光强度的中值。各个条的组从左到右显示了报告子、重组酶和报告子+重组酶的数据。图10显示了来自测试各种丝氨酸整合酶的表达的瞬时293FT细胞转染分析的数据。用等比率的报告质粒、重组酶质粒和转染标记质粒(例如，编码BFP的质粒)瞬时转染293FT细胞。分析细胞在转染后24小时的GFP荧光并且针对BFP表达进行门控。柱状图表示具有和不具有重组酶的转染的细胞群体。图11显示了用于位点特异性整合的基于重组酶的切除构建体的实例。将编码基于重组酶的切除构建体的入门载体整合至表达YFP和潮霉素的预先工程化的293FT着陆垫(landingpad)细胞系中。成功的整合驱动嘌呤霉素的表达。图12显示了GFP报告子成功地整合至293FT着陆垫细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化遗传构建体，其包含含有(a)编码第一目标产物的核苷酸序列和(b)编码第二目标产物和反选标记的核苷酸序列的盒，其中所述第一目标产物的表达或活性是可激活的，并且其中所述第一目标产物调节所述盒的切除或降解。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.26 US 62/366,7551.一种工程化遗传构建体，其包含含有(a)编码第一目标产物的核苷酸序列和(b)编码第二目标产物和反选标记的核苷酸序列的盒，其中所述第一目标产物的表达或活性是可激活的，并且其中所述第一目标产物调节所述盒的切除或降解。2.权利要求1的工程化遗传构建体，其中所述第一目标产物是重组酶。3.权利要求2的工程化遗传构建体，其中所述重组酶是配体依赖性嵌合重组酶。4.权利要求3的工程化遗传构建体，其中所述配体依赖性嵌合重组酶连接于突变的人雌激素受体(ER)配体结合结构域。5.权利要求3的工程化遗传构建体，其中所述重组酶是分裂重组酶，其包括在组合时形成所述重组酶的第一片段和第二片段。6.权利要求5的工程化细胞，其中所述第一片段和所述第二片段的二聚化是可诱导的。7.权利要求5的工程化细胞，其中所述第一片段连接于FKBP结构域，而所述第二片段连接于FRB结构域。8.权利要求2的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自酪氨酸重组酶和酪氨酸整合酶。9.权利要求8的工程化遗传构建体，其中所述重组酶是选自Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022和HP1重组酶的酪氨酸重组酶。10.权利要求2任一项的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自丝氨酸重组酶和丝氨酸整合酶。11.权利要求10的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1和R4重组酶。12.权利要求2-11任一项的工程化遗传构建体，其中所述盒侧翼为同源重组酶识别位点。13.权利要求1的工程化遗传构建体，其中所述第一目标产物是核酸酶。14.权利要求13的工程化遗传构建体，其中所述核酸酶选自大范围核酸酶、RNA指导核酸酶、锌指核酸酶和转录激活子样效应核酸酶。15.权利要求14的工程化遗传构建体，其中所述核酸酶是选自内含子核酸内切酶和内含肽核酸内切酶的大范围核酸酶。16.权利要求14的工程化遗传构建体，其中所述核酸酶是选自Cas9核酸酶和Cpf1核酸酶的RNA指导核酸酶。17.权利要求16的工程化遗传构建体，其中所述盒进一步包含编码与核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)的核苷酸序列。18.权利要求13-17任一项的工程化遗传构建体，其中所述盒包含同源核酸酶识别位点。19.权利要求1-18任一项的工程化遗传构建体，其中(a)的所述核苷酸序列可操作地连接于诱导型启动子。20.权利要求1-19任一项的工程化遗传构建体，其中(b)的所述核苷酸序列可操作地连接于组成型启动子。21.权利要求1-18任一项的工程化遗传构建体，其中(a)和(b)的所述核苷酸序列可操作地连接于单一组成型启动子。22.权利要求1-21任一项的工程化遗传构建体，其中所述第二目标产物是治疗性分子或预防性分子。23.权利要求1-22任一项的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是蛋白质、肽或核酸。24.权利要求23的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是选自RNA、DNA或RNA和DNA的组合的核酸。25.权利要求24的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是选自短发夹RNA、短干扰RNA和微RNA的RNA。26.权利要求1-25任一项的工程化遗传构建体，其中所述反选标记是前药。27.权利要求1-25任一项的工程化遗传构建体，其中所述反选标记选自胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶。28.一种包含权利要求1-27任一项的工程化遗传构建体的载体，任选地其中所述载体是质粒或病毒载体。29.一种包含权利要求1-27任一项的工程化遗传构建体或权利要求28的载体的细胞。30.权利要求29的细胞，其中所述细胞是干细胞或免疫细胞。31.权利要求30的细胞，其中所述细胞是选自间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞的干细胞。32.权利要求30的细胞，其中所述细胞是选自自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T细胞和B细胞的免疫细胞。33.权利要求32的细胞，其中所述细胞是选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞的T细胞。34.权利要求32或33的细胞，其中所述T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞或工程化T细胞受体(TCR)细胞。35.一种包含权利要求1-27任一项的工程化遗传构建体、权利要求28的载体或权利要求29-34任一项的细胞的组合物。36.一种包括权利要求1-27任一项的工程化遗传构建体或权利要求28的载体和至少一种诱导剂和/或反选剂的试剂盒。37.一种方法，包括将权利要求1-27任一项的工程化遗传构建体或权利要求28的载体引入细胞群体中。38.一种将权利要求29-34任一项的细胞递送至受试者的方法。39.一种包含盒的工程化遗传构建体，所述盒包含：(a)可操作地连接于编码重组酶的核苷酸序列的诱导型启动子；和(b)可操作地连接于编码目标产物和反选标记的核苷酸序列的启动子，其中所述盒侧翼为同源重组酶识别位点。40.权利要求39的工程化遗传构建体，其中(a)在(b)的上游。41.权利要求39或40的工程化遗传构建体，其中终止子序列位于(a)和(b)之间。42.权利要求39-41任一项的工程化遗传构建体，其中(a)包含至少两个诱导型启动子，各自连接于不同的重组酶，并且其中所述盒侧翼为对于所述不同的重组酶同源的重组酶识别位点。43.权利要求39-41任一项的工程化遗传构建体，其中(a)的核苷酸序列编码至少两种不同的重组酶，并且其中所述盒侧翼为对于所述不同的重组酶同源的重组酶识别位点。44.权利要求39-43任一项的工程化遗传构建体，其中(b)的核苷酸序列编码至少两种反选标记。45.权利要求39-44任一项的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自酪氨酸重组酶和酪氨酸整合酶。46.权利要求45的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022和HP1重组酶。47.权利要求39-46任一项的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自丝氨酸重组酶或丝氨酸整合酶。48.权利要求47的工程化遗传构建体，其中所述重组酶选自γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1和R4重组酶。49.权利要求39-48任一项的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是治疗性分子或预防性分子。50.权利要求39-49任一项的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是蛋白质、肽或核酸。51.权利要求50的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是选自RNA、DNA或RNA和DNA的组合的核酸。52.权利要求51的工程化遗传构建体，其中所述目标产物是选自短发夹RNA、短干扰RNA和微RNA的RNA。53.权利要求39-52任一项的工程化遗传构建体，其中所述反选标记是前药。54.权利要求39-52任一项的工程化遗传构建体，其中所述反选标记选自胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶。55.一种包含权利要求39-54任一项的工程化遗传构建体，任选其中所述载体是质粒或病毒载体。56.一种包含权利要求39-54任一项的工程化遗传构建体或权利要求55的载体的细胞。57.权利要求56的细胞，其中所述细胞是干细胞或免疫细胞。58.权利要求57的细胞，其中所述细胞是选自间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞的干细胞。59.权利要求57的细胞，其中所述细胞是选自自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T细胞和B细胞的免疫细胞。60.权利要求59的细胞，其中所述细胞是选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞的T细胞。61.权利要求59或60的细胞，其中所述T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞或工程化T细胞受体(TCR)细胞。62.一种包含权利要求39-54任一项的工程化遗传构建体、权利要求55的载体或权利要求56-61任一项的细胞的组合物。63...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·KT·卢，R·王，
申请(专利权)人：森迪生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US