本发明专利技术涉及新的甲基乙二醛还原酶(MGR)，其用于将甲基乙二醛有效转化为羟丙酮。本发明专利技术更特别地涉及一种用于使用所述酶将甲基乙二醛有效转化为羟丙酮的方法，涉及一种用于使用过表达所述酶的微生物产生1,2‑丙二醇的方法，且涉及所述微生物。
Conversion of methyl glyoxal into hydroxyacetone by new enzymes and its application
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用新的酶将甲基乙二醛转化为羟基丙酮及其应用简介本专利技术涉及新的甲基乙二醛还原酶(MGR)酶，其用于将甲基乙二醛有效转化为羟基丙酮。本专利技术更特别地涉及一种用于使用所述酶将甲基己二醛有效转化为羟基丙酮的方法，涉及一种用于使用过表达所述酶的微生物产生1,2-丙二醇的方法，且涉及所述微生物。1,2-丙二醇或丙二醇，具有式C3H8O2或HO-CH2-CHOH-CH3的C3二醇，是广泛使用的化学制品，以其CAS号57-55-6公知，其已经具有大量工业应用，举例来说，例如在制药、化妆品、航空学、食品业、烟草和纺织品中的应用。它是无色、几乎无味、清澈的粘性液体，具有微弱的甜味、吸湿性且可与水、丙酮和氯仿混溶，主要用作不饱和聚酯树脂的成分，但也用作用于航空器的液体去垢剂、冷却剂、防冻和除冰液的成分。它还可以用作食品中的润湿剂(E1520)、溶剂和防腐剂以及用于烟草产品。乙烯衍生物被认为比丙烯衍生物具有更大的毒性，自从1993-1994年以来，丙二醇已经越来越多地用作乙烯衍生物的替代品。1,2-丙二醇目前主要通过化学方法使用氧化丙烯水合作用工艺产生，这消耗大量的水、采用高毒性的物质且产生副产物例如叔丁醇和1-苯基乙醇。这样的化学工艺还有代表性地导致产生(R)-1,2-丙二醇和(S)-1,2-丙二醇的混合物。微生物中产生1,2-丙二醇的天然的或合成的代谢途径代表了有吸引力的替代选择，因为它缓解了以上所述的许多问题。迄今为止，两个天然生物途径已经经表征用于在微生物中从糖开始发酵产生1,2-丙二醇。在第一个途径中，该第一个途径在厌氧条件下在大肠杆菌中起作用，将6-脱氧糖(例如L-鼠李糖或L-岩藻糖)切割为磷酸二羟丙酮和(S)-乳醛，(S)-乳醛进一步由1,2-丙二醇氧化还原酶还原为(S)-1,2-丙二醇，1,2-丙二醇氧化还原酶也被称为乳醛还原酶(LAR)且由fucO基因编码(Badia等,1985)。但是，由于脱氧己糖底物的成本提高，因此依赖于该途径的发酵工艺在经济上是不可行的。第二个天然途径涉及常见糖(例如葡萄糖和木糖)的代谢，更具体地包括糖酵解途径随后是丙酮醛途径。该途径将磷酸二羟丙酮转化为甲基乙二醛，然后甲基乙二醛可以被还原为(R)-乳醛或羟丙酮(即丙酮醇)，这取决于还原酶的特性。这两个化合物然后被转变成(R)-1,2-丙二醇。该途径典型地在天然产生(R)-1,2-丙二醇的微生物例如楔形梭状芽胞杆菌(Clostridiumsphenoides)和热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)中观察到。但是，这些生物表现出的生产性能非常有限。考虑到甲基乙二醛途径在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中起作用，已经进行了一些研究以工程化改造合成途径，用于在所述微生物(更特别在大肠杆菌)中使用简单碳源来提高1,2-丙二醇的产量(WO98/37204；Cameron等,1998；Altaras和Cameron,1999；Huang等,1999；Altaras和Cameron,2000；Berrios-Rivera等,2003)。在经重组工程化产生1,2-丙二醇的大肠杆菌菌株中，可以以三步从中心代谢衍生出1,2-丙二醇。甲基乙二醛合成酶将磷酸二羟丙酮转化为甲基乙二醛是强制性的第一步，随后是通过甲基乙二醛还原酶将甲基乙二醛转化为(R)-乳醛或羟丙酮的第二步(Cameron等，1998；Bennet等,2001；Ko等,2005)。已经表明NADPH依赖性醛还原酶YqhD更特别地将甲基乙二醛转化为羟丙酮(WO2008/116853)，同时已经表明甘油脱氢酶GldA将甲基乙二醛转化为(R)-乳醛(Subedi等,2008)。在最后一步中，羟丙酮或乳醛通过不同的酶学活性(特别是甘油脱氢酶(由gldA基因编码)或1,2-丙二醇氧化还原酶(由fucO基因编码))转化为1,2-丙二醇(Altaras和Cameron,2000)。为了进一步提高所述大肠杆菌菌株中1,2-丙二醇的产量，已经用新的突变YqhD酶代替天然的YqhD酶，该新的突变YqhD酶展示出更高的催化效率(即增加的kcat/Km)和对甲基乙二醛和NADPH的亲和力，特别是突变酶YqhD*(G149E)(YqhD:kcat/Km＝0.4mM-1.s-1和Km＝2.09mM,相对于YqhD*(G149E):kcat/Km＝0.8mM-1s-1和Km＝2.92mM)(WO2011/012697)。但是，专利技术人已经观察到，YqhD*(G149E)必须在微生物内高表达以便允许产生1,2-丙二醇，这导致代谢负荷，因此由于剥夺碳和能源而对微生物产生压力。因此，本领域中存在提供可供选择的甲基乙二醛还原酶(MGR)的需求，其能够在更低表达水平下以更高的催化效率还原甲基乙二醛代谢，以便有效地产生(R)-1,2-丙二醇。本专利技术解决了以上所述的本领域的需求。专利技术人事实上已经惊人地发现，目前被称为是使用多种底物例如己醛、甘油醛或丁醛的还原酶的酶还能够使用甲基乙二醛作为底物，由此能够将所述底物转化为羟丙酮。预料不到的是，所述酶展示出比YqhD*(G149E)高至少7倍的对甲基乙二醛和NADPH的催化功效。基于该发现，专利技术人已经修饰了现有的产生1,2-丙二醇的大肠杆菌菌株，且观察到所述菌株能够产生更多以克计1,2-丙二醇/生物量，同时保持比YqhD*(G149E)更低表达水平的这些新的甲基乙二醛还原酶。因此本专利技术在本文中提供了一种改进的通过使用所述酶在微生物中将甲基乙二醛有效转化为羟丙酮的方法，一种在微生物中产生1,2-丙二醇的方法，以及过表达所述酶的产生1,2-丙二醇的微生物。专利技术详述应理解，以下详细描述不是限制性的，并且可以在不偏离本专利技术范围的情况下进行多种修饰、替换、省略和改变。还应理解，本文所用的术语是为了描述本专利技术的具体实施方案的目的，并且不意欲进行限制。本文在上下文中引用的所有公开、专利和专利申请，以其整体通过引用并入本文。此外，除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。常规微生物和分子生物学技术也是本领域公知且常用的那些。这样的技术对本领域技术人员来说是熟知的，并且在文献中有完整的解释。除非上下文清楚地另有说明，否则单数形式“一”(“a”和“an”)和“该”包括复数提及。术语“包含”、“含有”、“涉及”或“包括”或变化例如“包含”(“comprises,”“comprising”)、“涉及的”(“involved”)、“包括”(“includes”、“including”)在本文中以包括的意思使用，即用于指定所指特征存在但不排除本专利技术的多个实施方案中又一特征的存在或添加。术语酶的“活性”、“催化活性”或“功能”在本专利技术的上下文中是指由所述酶催化的用于将其一种或多种相应的底物转化成一种或多种另外分子(产物)的反应。如本领域公知的，酶的活性可以通过测量其催化效率和/或米氏常数来评估。酶的“催化效率”或“专一性常数”提供了其性能的直接度量，或者换句话说，提供了酶如何有效地将其一种或多种底物转化为一种或多种产物的直接度量。事实上，催化效率越高，将给定量的一种或多种底物转化成一种或多种产本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于将甲基乙二醛发酵转化为羟丙酮的方法，其包括在微生物中表达至少一种甲基乙二醛还原酶的步骤，所述甲基乙二醛还原酶具有等于或大于5mM
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.29 EP 16306848.91.一种用于将甲基乙二醛发酵转化为羟丙酮的方法，其包括在微生物中表达至少一种甲基乙二醛还原酶的步骤，所述甲基乙二醛还原酶具有等于或大于5mM-1s-1的催化效率kcat/Km，其中所述甲基乙二醛还原酶选自序列SEQIDNO:1的YjgB酶及其突变体、序列SEQIDNO:3的YahK酶及其突变体、序列SEQIDNO:5的YhdN酶及其突变体、序列SEQIDNO:7的Gld酶及其突变体，以及其组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲基乙二醛还原酶是序列SEQIDNO:1的YjgB酶。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述YjgB酶与序列SEQIDNO:3的YahK酶、序列SEQIDNO:5的YhdN酶、序列SEQIDNO:7的Gld酶、序列SEQIDNO:11的YafB酶或序列SEQIDNO:13的YqhD酶组合表达。4.一种用于发酵产生1,2-丙二醇的方法，其包括以下步骤：a)在发酵条件下在包含碳水化合物作为碳源的培养基中培养微生物，所述微生物经遗传修饰用于产生1,2-丙二醇；和b)从所述培养基中回收1,2-丙二醇，其中所述微生物过表达至少一种编码如权利要求1至3中任一项限定的甲基乙二醛还原酶的基因，且将甲基乙二醛有效转化为羟丙酮。5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括步骤c)：纯化从步骤b)回收的1,2-丙二醇。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述微生物进一步包含编码序列SEQIDNO:13或SEQIDNO:15的甲基乙二醛还原酶的yqhD或yqhD*基因的缺失。7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述微生物进一步过表达编码序列SEQIDNO:21的NADH依赖性甘油脱氢酶的gldA基因或编码序列SEQIDNO:23的NADH依赖性甘油脱氢酶的其突变体。8.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述微生物进一步过表达至少一种编码NADPH依赖性丙酮醇还原酶的基因，所述NADPH依赖性丙酮醇还原酶与序列SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87和SEQIDNO:5中的任一个具有至少60％氨基酸同一性。9.根据权利要求8所述的方法，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·富尔，G·科雷，C·雷诺，L·迪蒙赛格诺维特，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR
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