用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物技术

本发明专利技术涉及用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和重组微生物。本发明专利技术的方法涉及仅一步的发酵本发明专利技术的经修饰的微生物，或者一步的发酵本发明专利技术的经修饰的微生物和一步的乙醇酸或乙醛酸的生物学或化学转化，过表达磷酸转酮酶基因的本发明专利技术的微生物。

Methods and microorganisms for the production of glycolic acid and/or glyoxylic acid

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物
本专利技术涉及用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和重组微生物。本专利技术的微生物经以下方式修饰：通过过表达磷酸转酮酶活性增加基于碳源的乙醇酸和/或乙醛酸产率。本专利技术的方法涉及仅一步的发酵本专利技术的经修饰的微生物，或者一步的发酵本专利技术的经修饰的微生物和一步的乙醇酸或乙醛酸的生物学或化学转化。
技术介绍
羧酸是含有至少一个羧基的有机化合物。羧酸广泛存在，并且包括例如氨基酸(其组成蛋白质)和乙酸(其是醋的一部分并且出现在新陈代谢中)。羧酸用于产生聚合物、药物、溶剂和食物添加剂。工业上重要的羧酸包括乙酸(醋的组分，溶剂和涂料的前体)、丙烯酸和甲基丙烯酸(聚合物的前体、粘合剂)、乙二酸(聚合物)、柠檬酸(饮料)、乙二胺四乙酸(EDTA)(螯合剂)、脂肪酸(涂料)、马来酸(聚合物)、丙酸(食品防腐剂)、对苯二甲酸(聚合物)、丁酸(食品添加剂)、琥珀酸(食品添加剂、聚合物)。乙醇酸(HOCH2COOH,CAS号:79-14-1)或其共轭碱的乙醇酸盐是羧酸的α羟基酸家族的最简单成员。乙醇酸在非常小的分子上具有醇基和中度强酸官能团二者的双功能。其性质使得它称为广泛的消费者和工业应用的理想选择，包括用于水井复原、皮革工业、石油和天然气产业、洗衣及纺织工业、清洁产品以及作为个人护理用品的成分。其还可用于产生多种聚合物材料，包括具有优异的气体屏障特性的包含聚乙醇酸的热塑性树脂，因此其可用于制造具有相同特性的包装材料(例如饮料容器等)。这些聚酯聚合物在水性环境中以可控的速度逐渐水解。该特性使得它们可用于生物医学应用例如可溶解的缝合线，且可用于其中需要酸受控地释放以降低pH的应用。虽然乙醇酸作为痕量组分天然存在于甘蔗、甜菜、葡萄和水果中，但是它主要是通过合成产生的。在文献中或在专利应用中描述了产生乙醇酸的其它技术。例如，EP2025759和EP2025760专利申请描述了一种用于通过使用微生物从在末端具有羟基的脂肪多元醇产生所述羟基羧酸的方法。该方法是生物转化，正如MichihikoKataoka在关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的文献中所描述的那样(Kataoka等,2001)。乙醇酸还通过生物转化使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶从乙醇腈产生，该技术公开在专利申请WO2006/069110、WO2009/059104和WO2009/059096中，或通过生物转化从乙二醇、乙醇醛或乙二醛产生，如在专利申请JP2007/228927或WO2005/106005中所公开的。WO2007/141316、WO2010/108909、WO2011/036213、WO2011/157728、WO2012/025780、CN105647844A、CN106011185A和WO2016/079440(关于使用大肠杆菌菌株的方法)以及WO2013/050659、WO2014/162063和WO2016/193540(使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)菌株)公开了用于通过发酵从可再生资源产生乙醇酸的方法和微生物，其中碳水化合物通过一个直接的发酵步骤被转化为乙醇酸。乙醇酸或氧乙酸(HCOCOOH,CAS号:298-12-4)或其共轭碱的乙醛酸盐是C2羧酸。乙醛酸是乙醛酸循环的中间物，乙醛酸循环使得生物体(诸如细菌、真菌和植物)能够将脂肪酸转化为碳水化合物。乙醛酸盐是在若干酰胺化肽的生物合成中酰胺化过程的副产物。它是天然存在并在工业上有用的无色固体。其用作清洁剂用于多种工业应用，用作特种化学及可生物降解共聚物原料和用作化妆品中的成分。它是一种对于农业和药物化学有用的化合物。事实上，乙醛酸可用于药物工业，因为其与酚类缩合产生4-羟基苯基乙醇酸，4-羟基苯基乙醇酸与氨反应产生羟苯基甘氨酸，羟苯基甘氨酸是药物阿莫西林(amoxicillin)的前体，或4-羟基扁桃酸经还原产生4-羟基苯乙酸，4-羟基苯乙酸是药物阿替洛尔(atenolo)的前体。此外，乙醛酸与尿素的酸催化的反应导致产生在化妆品、油膏和在治疗一些癌症中使用的尿囊素(Cativiela等,2003)。最后，用愈创木酚代替苯酚的缩合提供获得用作食品、饮料和药物中的调味剂的香草醛的途径。虽然乙醛酸在未成熟水果和幼嫩的绿叶中作为痕量组分天然存，但它主要是通过合成产生的。产生乙醛酸的其它技术描述于文献中或专利申请中。例如，乙醛酸可以通过用一些水加热二溴乙酸或通过电解还原草酸或通过氮氧化乙二醛而化学合成。一些专利申请描述了通过生物转化产生乙醛酸的方法，例如专利申请WO1993/14214、US5,439,813和WO1994/28155公开了使用由微生物产生的乙醇酸氧化酶从乙醇酸生物转化，以及Isobe&Nishise(1999)。专利申请US2007/0026510公开了使用醛氧化酶从乙二醛生物转化。乙醇酸和乙醛酸的工业利益，加上化学生产过程中形成的化学副产品引起的环境问题，使得微生物生产这种羧酸具有诱人的前景。专利技术人已经鉴定了用于从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的新的方法，该方法涉及至少一个发酵步骤以及其中磷酸转酮酶的活性被增强的经修饰的微生物。磷酸转酮酶活性和编码具有这样的活性的酶的基因是本领域已知的(Papini等，2012)。已经报道了细菌中的两种不同的磷酸转酮酶活性。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶催化5-磷酸木酮糖消耗磷酸地转化为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，伴随释放水。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶例如由来自戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)的xpkA基因编码(Posthuma等，2002)。6-磷酸果糖磷酸转酮酶催化6-磷酸果糖磷酸消耗磷酸地转化为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸，伴随释放水。一些基因编码同时具有5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性的磷酸转酮酶，例如，由来自乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)(Meile等,2001)或动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)(WO2006/016705和WO2016/044713)的基因xfp编码的蛋白质的情况。磷酸转酮酶用于产生感兴趣的代谢物的用途是已经知晓的，并且已经公开在专利申请WO2006/016705和WO2016/044713中。这种感兴趣的代谢物是谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、聚羟基丁酸酯和1,4-丁二醇。磷酸转酮酶用于产生乙醇酸或乙醛酸的用途从未被公开。本专利技术的方法和微生物相对于现有技术是新的，因为磷酸转酮酶用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的用途以前从未被公开。专利技术人已经惊奇地发现，在本专利技术的微生物中磷酸转酮酶的过量产生改善了乙醇酸和/或乙醛酸的产生。专利技术人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本专利技术的经修饰的微生物，或者一步的发酵本专利技术的经修饰的微生物和一步的生物学或化学转化乙醇酸或乙醛酸。
技术实现思路
本专利技术涉及重组微生物和用于改善从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸并且使用至少一步的发酵和经修饰的微生物的方法，在所述经修饰的微生物中，选自aceB、glcB、gcl和eda中的至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于使用至少一步的发酵和经修饰的微生物从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法，其中在所述经修饰的微生物中：‑选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，并且‑编码5‑磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6‑磷酸果糖磷酸转酮酶的至少一种基因的表达被增强。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.26 EP 17305084.01.一种用于使用至少一步的发酵和经修饰的微生物从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法，其中在所述经修饰的微生物中：-选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，并且-编码5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶的至少一种基因的表达被增强。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码磷酸转酮酶的基因选自：来自戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)的xpkA基因、来自动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)的xfp基因或来自乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)的xfp基因，或它们的异源基因。3.根据权利要求1或2所述的用于产生乙醇酸的方法，其中所述经修饰的微生物进一步过表达来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的ycdW基因或其异源基因。4.根据权利要求3所述的方法，其用于从乙醇酸产生乙醛酸，所述方法进一步包括以下步骤：-任选地从发酵肉汤中分离乙醇酸，-通过乙醇酸的生物转化使用由来自大肠杆菌的gldDEFG基因编码的乙醇酸氧化酶和由来自大肠杆菌的katE或katG基因编码的过氧化氢酶或通过化学转化使用氮氧自由基催化剂将乙醇酸转化为乙醛酸，-回收乙醛酸。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶在同一微生物中表达。6.根据权利要求1或2所述的用于产生乙醛酸的方法，其中在所述经修饰的微生物中，至少来自大肠杆菌的ycdW基因被弱化。7.根据权利要求6所述的方法，其用于从乙醛酸产生乙醇酸，所述方法进一步包括以下步骤：-任选地从发酵肉汤中分离乙醛酸，-通过乙醛酸的生物转化使用由来自大...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·迪彻特，G·科雷，P·索凯尔，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR