生产目标物质的方法技术

提供了用于生产目标物质诸如香草醛和香草酸的方法。通过使用具有目标物质生产能力的微生物从碳源或目标物质的前体生产目标物质，所述微生物已经以S‑腺苷‑L‑高半胱氨酸水解酶活性得以增加的方式进行了修饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产目标物质的方法专利
本专利技术涉及通过使用微生物生产目标物质，诸如香草醛和香草酸的方法。专利技术背景香草醛是提供香草气味的主要成分，并且用作食品、饮料、香水等中的芳香物。香草醛通常通过从天然产物中提取或通过化学合成来生产。已经尝试在生产香草醛的方法中尝试生物工程技术，例如通过使用各种微生物与丁香油酚、异丁香油酚、阿魏酸、葡萄糖、香草酸、椰子壳等(KaurB.andChakrabortyD.,Biotechnologicalandmolecularapproachesforvanillinproduction:areview.ApplBiochemBiotechnol.2013Feb；169(4):1353-72)。另外，使用生物工程技术生产香草醛的其他方法包括以糖苷生产(WO2013/022881和WO2004/111254)，使用香草醛合酶从阿魏酸生产香草醛(JP2015-535181)，通过大肠杆菌发酵来生产香草酸，然后将香草酸酶促转化为香草醛(美国专利No.6,372,461)。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶是作为甲基化循环的SAM循环的酶，其催化水解S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)以产生L-高半胱氨酸和腺苷的反应。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的实例可以包括SahH蛋白，其由sahH基因编码。专利技术概述本专利技术描述了用于改善目标物质诸如香草醛和香草酸的生产的新技术，因此提供了用于有效生产目标物质的方法。本专利技术的一方面是通过以S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的活性得以增加的方式修饰微生物，微生物可以以显著改善的方式生产目标物质诸如香草酸。本专利技术的一方面提供了生产目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的活性得以增加的方式进行了修饰，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：L-甲硫氨酸、需要S-腺苷甲硫氨酸来进行生物合成的代谢物和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述生产包括：在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述生产包括：通过使用所述微生物来将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述转化包括：在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述转化包括：在反应混合物中允许所述微生物的细胞作用于所述前体以在所述反应混合物中生产和积累所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述细胞是存在于所述微生物的培养液中的细胞、从所述培养液中收集的细胞、存在于所述培养液的加工产物中的细胞、存在于收集的细胞的加工产物中的细胞，或这些的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述前体选自由以下组成的组：原儿茶酸、原儿茶醛、L-色氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酸和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，所述方法还包括收集所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶是由sahH基因编码的蛋白质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述sahH基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(a)包含SEQIDNO:145的氨基酸序列的蛋白质，(b)包含SEQIDNO:145的氨基酸序列，且该氨基酸序列包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质，且其中所述蛋白质具有S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性，和(c)包含与SEQIDNO:145的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中通过增加编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的基因的表达来增加S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的活性。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数和/或对所述基因的表达控制序列进行修饰来增加编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的基因的表达。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌细菌或酵母。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于棒状杆菌属的细菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于埃希氏菌属的细菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述代谢物选自由以下组成的组：香草醛、香草酸、褪黑激素、麦角硫因、麦根酸、阿魏酸、多胺、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚和肌酸。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比参与所述目标物质的生物合成的酶的活性得以增加的方式进行了进一步修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述参与目标物质的生物合成的酶选自由以下组成的组：3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氢莽草酸脱水酶、O-甲基转移酶、芳族醛氧化还原酶和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性得以增加的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比参与除所述目标物质以外的物质的副生产的酶的活性得以降低的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述参与除目标物质以外的物质的副生产的酶选自由以下组成的组：香草酸脱甲基酶、原儿茶酸3,4-双加氧酶、醇脱氢酶、莽草酸脱氢酶和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加的方式进行了进一步修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述L-半胱氨酸生物合成酶是由选自由以下组成的组的基因编码的蛋白质：cysI基因、cysX基因、cysH基因、cysD基因、cysN基因、cysY基因、cysZ基因、fpr2基因和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中通过增加由cysR基因编码的蛋白质的活性来增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比由NCgl2048基因编码的蛋白质的活性得以降低的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比烯醇化酶的活性得以降低的方式进行了进一步修饰。本专利技术的另一方面提供了生产香草醛的方法，所述方法包括：通过如上文所述的方法来生产香草酸；和将所述香草酸转化成香草醛。专利技术详述<1>微生物如本文所述的微生物是具有生产目标物质的能力的微生物，所述微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比S‑腺苷‑L‑高半胱氨酸水解酶的活性得以增加的方式进行了修饰，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：L‑甲硫氨酸、需要S‑腺苷甲硫氨酸来进行生物合成的代谢物和它们的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.26 US 62/413,0561.一种生产目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的活性得以增加的方式进行了修饰，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：L-甲硫氨酸、需要S-腺苷甲硫氨酸来进行生物合成的代谢物和它们的组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产包括：在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产包括：通过使用所述微生物来将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述转化包括：在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述转化包括：在反应混合物中允许所述微生物的细胞作用于所述前体以在所述反应混合物中生产和积累所述目标物质。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞是存在于所述微生物的培养液中的细胞、从所述培养液中收集的细胞、存在于所述培养液的加工产物中的细胞、存在于收集的细胞的加工产物中的细胞，或这些的组合。7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述前体选自由以下组成的组：原儿茶酸、原儿茶醛、L-色氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酸和它们的组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括收集所述目标物质。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶是由sahH基因编码的蛋白质。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述sahH基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(a)包含SEQIDNO:145的氨基酸序列的蛋白质，(b)包含SEQIDNO:145的氨基酸序列，且该氨基酸序列包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质，且其中所述蛋白质具有S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性，和(c)包含与SEQIDNO:145的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过增加编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的基因的表达来增加S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的活性。12.根据权利要求11所述的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数和/或对所述基因的表达控制序列进行修饰来增加编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的基因的表达。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌细菌或酵母。14.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：B米吉茨，C罗切，P凯利，朝里彩香，福井启太，户矢崎未来，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP