催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用。本发明专利技术提供了CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；或CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术发现CAR新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。

Preparation and application of CAR enzyme for catalytic synthesis of formaldehyde from formic acid

The invention discloses the preparation and application of CAR enzyme for catalyzing formic acid to synthesize formaldehyde. The invention provides the application of CAR protein or its coding gene or recombinant carrier or recombinant bacteria containing the coding gene in catalyzing formaldehyde synthesis from formic acid; or the application of CAR protein or its coding gene or recombinant carrier or recombinant bacteria containing the coding gene in preparing formaldehyde products from formic acid synthesis. The experiment of the invention proves that the CAR new function can be used to synthesize formaldehyde from formic acid, and creates a new way for synthesizing formaldehyde from formic acid.

【技术实现步骤摘要】
催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用。
技术介绍
从生态角度讲，甲酸是糖发酵的中间产物，易于在发酵过程中累积。同时，甲酸还可以作为生成下游还原性代谢产物的原料，例如，生成乙醇，甲烷，氢气等。从生物技术角度讲，甲酸可以来源于二氧化碳还原、生物质选择性氧化、天然气部分氧化及合成气的氢化。因此甲酸可以作为连接物理化学与生物领域的桥梁，研究甲酸的同化途径具有重要的意义。自然界存在的甲酸固定反应主要有甲酸直接还原反应、甲酸激酶反应、甲酸与乙酰辅酶缩合反应、乳酸合成反应等。甲酸的直接还原反应由甲醛脱氢酶催化，将甲酸直接还原为甲醛从热力学上是不利的，因此反应效率低下。甲酸激酶反应由甲酸-四氢叶酸连接酶催化，此同化途径路线长，需在厌氧条件下反应，因此应用受到限制。用乙酰辅酶A合成酶可以实现甲酸还原为甲醛，但目前利用效率依然不高。甲酸与乙酰辅酶缩合反应丙酮酸-甲酸裂合酶催化，此反应也是热力学甲酸有利的。乳酸合成反应即甲酸与乙醛缩合反应，目前还没有在体外成功实现。这些甲酸固定反应是甲酸同化途径的重要组成部分，目前最优的甲酸同化途径是人工合成途径：甲酸还原为甲醛，甲醛聚合生成二羟基丙酮，二羟基丙酮磷酸化直接进入中心代谢。CAR蛋白为carboxylicacidreductase(CAR)羧酸还原酶，催化一系列长链羧酸还原为相应的醛。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌的新用途。本专利技术提供了CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；或CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用。上述应用中，所述CAR蛋白来源于Mycobacteriummarinum。上述应用中，所述CAR蛋白为如下1)或2)：1)由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽。上述应用中，所述CAR蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：1)编码区为序列2的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子有大于70％同一性且编码具有相同功能多肽的DNA分子。本专利技术另一个目的是提供一种催化甲酸合成甲醛产品。本专利技术提供的产品，包括CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。上述产品为试剂盒。所述产品还包括NADPH、ATP和MgCl2。本专利技术第3个目的是提供一种催化甲酸合成甲醛的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：以甲酸为底物，用所述CAR蛋白催化甲酸合成甲醛。上述方法中，所述催化反应的条件为37℃反应2h。上述方法中，所述催化反应的所需的pH值为pH7.4。上述方法中，所述催化所在的体系包括NADPH、ATP、MgCl2、甲酸和CAR蛋白。上述每200ul所述体系由终浓度为1mM的NADPH、终浓度为1mMATP、终浓度为5mMMgCl2、终浓度为5mM甲酸、终浓度为1.5mg/ml所述CAR蛋白和pH＝7.4，50mM磷酸钾缓冲液(0.1MK2HPO3水溶液、0.1MKH2PO3水溶液、dH2O按照体积比为4:1:5混匀)组成。本专利技术的实验证明，本专利技术发现CAR新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。附图说明图1为重组质粒pET-28a-CAR的质粒图谱示意图。图2为甲醛检测标准曲线。图3为不同酶催化甲酸生成的甲醛浓度示意图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、CAR的获得1、CAR基因获得、载体构建CAR种属来源为Mycobacteriummarinum(strainATCCBAA-535/M)，其氨基酸序列如序列1所示。在不改变CAR编码的氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如序列2所示。将上述基因序列合成在pET-28a载体(Novagen，Kan+，见图1)上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒分别命名为pET-28a-CAR。pET-28a-CAR为将序列4所示的CAR基因替换pET-28a载体的NdeI和XhoI位点间的DNA片段得到的载体。2、基因的表达为了体外检测CAR酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-CAR转入E.coliBL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；(2)挑单克隆至5mLLB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6-0.8。将5mLLB培养基中菌液转接至800mL2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，200mMNaCl，5mMMgCl2，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。3、蛋白纯化(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50mL含50mM、100mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；d：洗脱目的蛋白：用20mL含200mM咪唑的蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测。(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mLAmicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加15mL不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白CAR、stAckA、ASD。(4)用Nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/mL，即得到CAR蛋白，其氨基酸序列分别如序列1所示。实施例2、CAR在催化甲酸生成甲醛中的应用1、CAR催化甲酸生成甲醛，反应方程式如下：2、酶活性检测:显色法检测甲醛生成量：利用《中华人民共和国国家环境保护标准HJ601-2011》中的甲醛测定方法检测甲醛含量。具体流程如下：A：配置乙酰丙酮溶液：将50g乙酸铵(CH3COONH4)、6mL冰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；或CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；或CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CAR蛋白来源于Mycobacteriummarinum。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述CAR蛋白为如下1)或2)：1)由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽。4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述CAR蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：1)编码区为序列2的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功...

【专利技术属性】
技术研发人员：江会锋，缑俊冉，杨晟，逯晓云，刘玉万，卢丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12