本发明专利技术涉及一种用于产生1,3‑丙二醇的新方法，该方法包括在包含甘油的培养基上培养将甘油转化为1,3‑丙二醇并过表达hcpR和/或frdX基因的重组微生物。一种用于从甘油产生1,3‑丙二醇的重组微生物，其中所述微生物将甘油转化为1,3‑丙二醇并过表达hcpR和/或frdX基因。
Microorganisms and methods for improving the production of 1,3-propanediol by fermentation on a medium with high glycerol content
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过在高甘油含量的培养基上发酵来改善1,3-丙二醇产生的微生物和方法
本专利技术涉及一种用于从具有高甘油含量的培养基产生1,3-丙二醇的新方法和微生物，优选地其中所述甘油为工业甘油。更特别地，该微生物过表达hcpR和/或frdX基因。
技术介绍
1,3-丙二醇(1,3-Propanediol)(PDO)，也称为丙二醇(trimethyleneglycol)或丙二醇(propyleneglycol)，是最古老的已知发酵产物之一。它最早于1881年由AugustFreund在含有巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)的甘油发酵培养物中鉴定。PDO是甘油发酵的一种典型产物，尽管它已在其他有机底物的厌氧转化中被发现。很少生物体(全部都是细菌)能够形成PDO。这些包括克雷伯氏菌(Klebsiella)属(肺炎克雷伯菌(K.bneumoniae))、肠杆菌属(Enterobacter)(聚团肠杆菌(E.agglomerans))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii))、乳杆菌属(Lactobacilli)(短乳杆菌(L.brevis)和布氏乳杆菌(L.buchneri))和梭菌属(Clostridia)(丁酸梭菌(C.butyricum)、巴氏梭菌(C.pasteurianum))的肠细菌。其中，就产量和滴度而言，丁酸梭菌(C.butyricum)被认为是PDO的最佳“天然产生者”。PDO，作为一种双官能有机化合物，可以潜在地用于许多不同的合成反应中，包括作为缩聚反应的单体，以产生聚酯、聚醚和聚氨酯，尤其是聚对苯二甲酸亚丙基酯(PTT)。考虑到PDO的结构和反应性，它还可以用作溶剂、粘合剂、去污剂、化妆品、纺织品(例如服装纤维或地板)和塑料(例如汽车工业、包装或作为涂料)中的成分。尽管可以使用各种化学方法产生PDO，但它们会产生包含极度污染物质的废物流，从而使以化学方法产生的PDO与石化二醇(例如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇和1,4-丁二醇)在成本上没有竞争力。尽管已描述了使用大肠杆菌(Escherichiacoli)将D-葡萄糖生物转化为PDO的一种更加环境友好的方法，但该方法具有若干主要缺点。值得注意的是，由于产生菌株的不稳定性，培养是不连续的，并且还需要添加昂贵的辅因子维生素B12。确实，尽管PDO可以通过维生素B12依赖性途径在大肠杆菌中产生，但大肠杆菌本身不产生这种辅因子。由于由生物柴油工业产生的包含甘油的大量工业甘油的可用性，使用工业甘油作为底物的连续、无维生素B12且碳收率较高的方法将是有利的。尽管纯甘油具有广泛的应用(例如，作为食品、药物或化妆品添加剂)，但生物柴油合成过程中产生的工业甘油通常包含与盐和水混合的80-85％的甘油，因此在其可以用作添加剂之前需要额外的纯化步骤。因此，与其他碳源(诸如葡萄糖或纯甘油)相比，工业甘油被视为废品，而不是有价值的商品，因此代表了PDO的丰富而廉价的发酵底物。梭状芽胞杆菌代表用于产生PDO的非常有希望的菌株。确实，丁酸梭菌能够使用纯甘油，但也可以使用工业甘油，作为在分批和两阶段连续发酵中通过B12非依赖途径产生PDO的唯一碳源(Papanikolaou等，2000)。但是，在最高甘油浓度下，以0.02h-1的稀释率获得的最大PDO滴度为48.1g/L，对应于0.96g/L/h的产生率。在进料培养基中最大甘油浓度为90g/L的情况下在酵母提取物(一种昂贵的含有机氮的化合物，已知会增加细菌生物量)的存在下进行培养。WO2006/128381公开了工业甘油在使用PDO的“天然产生者”，诸如肺炎克雷伯菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌的分批和补料分批培养物中产生PDO的用途。然而，WO2006/128381中使用的培养基也包含酵母提取物。达到的最大产生率也与Papanikolaou等人，2000中发现的产生率相似，在0.8至1.1g/L/h之间。Gonzalez-Pajuelo等人，2005中描述了被称为丙酮丁酸梭菌DG1pSPD5的重组丙酮丁酸梭菌菌株的性能，该菌株含有来自丁酸梭菌的维生素B12非依赖性甘油脱水酶和PDO脱氢酶。此菌株最初在含有高达120g/L的纯甘油的进料培养基中生长并产生PDO。此外，使用含有60g/L的纯甘油或工业甘油的补料培养基进行的分析未显示任何差异。这些结果也是在酵母提取物的存在下获得的。然而，未测试包含浓度高于60g/L的甘油的工业甘油。最近，WO2010/128070已经公开了丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5菌株，其已进一步适应于在高浓度的工业甘油上和不存在酵母提取物的情况下生长。丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5适应菌株的所得群体能够在含有相对高质量工业甘油的培养基中产生PDO，该工业甘油来源于Novance(Compiègne，法国)，其中甘油浓度高达120g/L，PDO滴度高达53.5g/L，产量高达0.53g/g，以及产生率高达2.86g/L/h。在专利申请WO2012/062832中，专利技术人描述了从通过与WO2010/128070中描述的相同的方法获得的丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5适应菌株群体中分离克隆“c08”。此克隆能够在包含源自Novance(Compiègne，法国)的相对高质量的工业甘油的培养基中产生PDO，该工业甘油甘油的甘油浓度约为105g/L。对于初始群体观察到PDO滴定度最高达50.45g/L，产量最高达0.53g/g，以及产生率最高达3.18g/L/h，而分离出的克隆c08在相同条件下显示出增加的PDO产量，PDO滴度最高达51.30g/L，产量高达0.50g/g，产生率最高达3.05g/L/h。尽管有这些改进，但仍需要来自甘油特别是来自工业甘油的增加的PDO产量(例如产量、滴度和/或产生率)。还需要从具有较高杂质(其可抑制PDO产生)含量的工业甘油和/或从不同来源获得的工业甘油产生PDO的方法和微生物。确实，工业甘油的组成可因制造商不同而有所变化，甚至在批次之间也有所变化。此外，工业甘油越来越多地被污染，其具有增加水平的会抑制生长和/或PDO产生的被称为有机非甘油物质(MONG)的杂质，包括脂肪酸(例如油酸、亚油酸)、醇、盐和金属。最后，需要具有降低水平的残留甘油的方法和微生物。确实，降低的残留甘油水平有助于下游PDO纯化。本专利技术提供了一种用于改进PDO的产生，特别是从工业甘油底物的PDO的产生的方法和微生物。确实，专利技术人惊奇地发现hcpR和/或frdX基因的过表达进一步改善了PDO产生，因为与其中未过表达hcpR和/或frdX基因的未修饰的菌株的性能相比时，观察到更高的PDO滴度和更高的产量。另外，本专利技术人惊奇地发现在连续培养过程中存在较少的残留甘油。专利技术人还发现，过表达hcpR和/或frdX基因的菌株能够在高浓度的在工业甘油中含有的甘油(例如最高达约105g/L)的存在下从越来越不纯的工业甘油以及从来自不同来源的工业甘油以这种增加的水平产生PDO。
技术实现思路
本专利技术涉及一种发酵产生PDO的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于发酵产生1,3-丙二醇的方法，其中在包含工业甘油的培养基上培养重组微生物，所述重组微生物将甘油转化为1,3-丙二醇并过表达hcpR和/或frdX基因。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170804 EP 17306044.31.一种用于发酵产生1,3-丙二醇的方法，其中在包含工业甘油的培养基上培养重组微生物，所述重组微生物将甘油转化为1,3-丙二醇并过表达hcpR和/或frdX基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过遗传修饰在所述重组微生物中过表达hcpR和/或frdX基因，所述遗传修饰例如通过使调控hcpR和/或frdX基因表达的启动子突变，通过使hcpR和frdX基因之间的基因间区域突变，通过基因复制，或通过从质粒中过表达hcpR和/或frdX基因，优选通过使hcpR和frdX基因之间的基因间区域突变。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因间突变是插入，优选单核苷酸插入，更优选“A”核苷酸，甚至更优选其中所述插入发生在重复的A核苷酸的区域中，优选至少七个“A”核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述重组微生物适于在高浓度工业甘油的存在下生长。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述工业甘油中的甘油浓度为90至120g/L，优选为约105g/L。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述工业甘油包含至少5％脂肪酸。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述工业甘油是生物柴油产生的副产物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述重组微生物选自梭状芽胞杆菌(Clostridium)属或克雷伯氏菌(Klebsiella)属。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·雷诺，O·图拉塞，N·杜莫林，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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