浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法，包括类原球茎诱导、增殖、分化及生根步骤。在液体培养基中，类原球茎诱导的优选培养条件为TDZ 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L，诱导率为62.5%；在固体培养基中，类原球茎诱导的优选培养条件为TDZ 0.6mg/L+ NAA 0.2mg/L+6‑BA 2.0mg/L，诱导率为59.3%。类原球茎增殖的优选培养条件为稀效唑1.5 mg/L+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，增殖系数为8.4，其中稀效唑是类原球茎增殖的主要因子。类原球茎分化的优选条件为6‑BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L，分化率为87.3%。植株生根诱导的优选培养条件为1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L，生根率达100%。

Methods to establish the rapid propagation system of Zhejiang jinxianlian tissue culture

The invention discloses a method for establishing Zhejiang Anoectochilus tissue culture rapid propagation system, including PLB Induction, proliferation, differentiation and rooting steps. In the liquid culture medium, culture conditions optimization of PLB Induction for TDZ 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L, the induction rate was 62.5%; in the solid culture medium, culture conditions optimization of PLB Induction for TDZ 0.6mg/L+ NAA 0.2mg/L+6 BA 2.0mg/L, the induction rate was 59.3%. Optimization of culture conditions for the proliferation of protocorm like body of Uniconazole 1.5 mg/L+6 BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L, the multiplication coefficient is 8.4, which is the main factor of Uniconazole protocorm-like proliferation. The optimum conditions of protocorm differentiation for 6 BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L, differentiation rate was 87.3%. Plant root induction optimization of culture condition for 1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L, the rooting rate was 100%.

【技术实现步骤摘要】
浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法
本专利技术属于植物组培领域，尤其是一种涉及浙江金线莲组织培养体系的建立方法。
技术介绍
浙江金线莲（Anoectochiluszhejiangensis）为兰科开唇兰属多年生珍稀草本植物，主要分布在浙江、福建等地，作为一种珍贵中草药，具有广阔的开发利用前景。浙江金线莲的生物学特性及药理活性与同属基原植物金线莲相近，对生长条件要求比较严格，自然萌发率不到千分之一，且自然繁殖时间长且繁殖率不高，再加上近年来人为大量采挖，导致浙江金线莲野生资源日趋枯竭，因此保护野生浙江金线莲已经到了刻不容缓的地步。植物组织培养是保护濒危植物的有效技术手段，可在短时间内繁殖出大量新生植株。在组织培养中，培养基的筛选将直接影响到组织培养的成功与否，植物激素的浓度配比将直接影响到植株快繁的效率。因此培养基与激素配比的选择对组织培养的成功与否具有重要作用。迄今有关金线莲基原植物，如中国台湾金线莲、金线莲、福建金线莲等快速繁殖体系的研究已有报道[王勇.金线莲组织培养新体系建立及优化.北方园艺,2010,13:178-179；陈永快,林一心,邹晖等.福建金线莲和中国台湾金线莲的组培快繁技术.现代园艺,2008,10:9-12.]，并发现不同基原植物间的快速繁殖体系相差较大，但是关于浙江金线莲组织培养方面的研究尚属空白。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本申请提供了一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法。一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法，包括类原球茎诱导、增殖、分化及生根步骤，其中，类原球茎的诱导、增殖及分化以MS为基本培养基，生根以1/2MS为基本培养基，加入植物生长调节剂，pH5.8，液体培养基蔗糖质量百分比浓度为5.0%，固体培养基蔗糖质量百分比浓度为3.0%，类原球茎分化培养基中添加质量含量10%香蕉泥；１）类原球茎诱导：采用液体培养基或固体培养基，液体培养基中含TDZ0.6mg/L+NAA0.4mg/L；固体培养基含TDZ0.6mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L；2）类原球茎增殖：增值培养基中含稀效唑1.5mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，其中稀效唑是类原球茎增殖的主要因子；3）类原球茎分化：对类原球茎进行分化培养，10天类原球茎球体顶部开始突起变尖，变绿，60天后可分化成带有茎节、叶片及幼小毛状根的小苗，分化培养基中含6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；4）植株生根：分化的幼苗在生根培养基中培养10d后开始有根长出，生根培养基中含NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L。所述１）类原球茎诱导，取生长健康的无菌苗，在超净工作台上将其叶片从柄部切除，气生根从基部切除，将茎切成含2-4个节的茎段。所述１）类原球茎诱导，采用液体培养基，第一次接种3天后即更换培养基，以后每7天更换1次培养基，90r/min，光照时间12h/d，3000lx，温度为25℃。所述类原球茎固体诱导、增殖、分化及生根的培养条件为：3000lx，光照时间12h/d，温度为25℃。本专利技术的有益效果是，为了解决资源稀缺问题，有必要建立其快速繁殖的最优体系。因此本申请以浙江金线莲为材料，探讨不同植物激素配比对类原球茎诱导、增殖、分化及生根的影响，建立植株快速繁殖的最优体系，为浙江金线莲的扩大培养打下基础，也为今后对浙江金线莲成分等方面的研究及开发利用提供条件。同时研究结果对解决金线莲基原植物资源保护与合理利用之间的矛盾具有一定的指导意义。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1是浙江金线莲类原球茎的诱导图；图2是浙江金线莲类原球茎的增殖图；图3是浙江金线莲类原球茎分化图；其中A部分：分化培养10d；B部分：分化培养60d；图4是60d后浙江金线莲的生根培养情况图，其中A部分：4号培养基；B部分：7号培养基；图5是120d后浙江金线莲的生根培养情况图，其中A部分：4号培养基，B部分：7号培养基；图6是180d后浙江金线莲的生根培养情况图，其中A部分：4号培养基，B部分：7号培养基。具体实施方式一、材料与方法1.1材料浙江金线莲（ZJJ）组培苗由同济大学丽水中药研究院资源植物实验室提供。1.2方法1.2.1培养基的配制类原球茎的诱导、增殖及分化以MS为基本培养基，生根培养以1/2MS为基本培养基，加入不同浓度的植物生长调节剂，pH5.8，液体培养基蔗糖质量百分比浓度为5.0%，固体培养基蔗糖质量百分比浓度为3.0%，类原球茎分化培养基中额外添加10%香蕉泥。所有培养基121℃高压灭菌20min，冷却备用。1.2.2类原球茎的诱导液体培养诱导类原球茎。选取TDZ和NAA各0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L3种浓度进行实验。取生长健康的无菌苗，在超净工作台上将其叶片从柄部切除，气生根从基部切除，将茎切成含2-4个节的茎段，随机接种到各组培养基中，每组4瓶，每瓶接种10个，第一次接种3d后即更换培养基，以后每7d更换1次培养基，接种31d后统计诱导出类原球茎的茎段数，取平均值计算其诱导率。诱导率=（诱导出类原球茎茎段数/接种茎段数）×100%。固体培养诱导类原球茎。选取TDZ0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、NAA0.2mg/L、0.4mg/L和6-BA2.0mg/L共5种浓度配比组合进行实验。茎段处理与3.2.2.1相同，随机接种到各组培养基中，每组3瓶，每瓶7个-8个，每7d更换1次培养基，接种30d后统计诱导出类原球茎的茎段数，取平均值计算其诱导率及诱导效率。诱导率=（诱导出类原球茎茎段数/接种茎段数）×100%；诱导效率=（诱导出的类原球茎个数/接种茎段数）×100%1.2.3类原球茎的增殖选取稀效唑0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，6-BA1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L和NAA0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L各3个浓度进行实验。将诱导出的带类原球茎的茎段随机接种到各组培养基中，每组5瓶，每瓶接种10个-15个，60d统计结果，取平均值计算增殖系数。增殖系数=（增殖出的类原球茎个数/接种茎段数）×100%。1.2.4类原球茎的分化选取6-BA0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L和NAA0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L各3种浓度进行实验。将增殖培养后的类原球茎切割成团，随机接种到各组培养基中，每组5瓶，每瓶接种5个类原球茎团，培养60d统计分化情况，取平均值计算分化率。分化率=（分化的类原球茎数/接种类原球茎数）×100%。1.2.5生根培养选取IBA和NAA各0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L3种浓度进行实验。将分化培养得到的幼嫩小苗（约2.0cm）随机接入生根培养基中，每组3瓶，每瓶接种7个-8个幼嫩小苗，每培养60d统计生根情况，取平均值计算生根率。生根率=（生根幼嫩小苗数/接种幼嫩小苗数）×100%。1.2.6培养条件类原球茎液体诱导的培养条件为：90r/min，光照时间12h/d，3000lx，25℃；类原球茎固体诱导、增殖、分化及生根的培养条件为：3000lx，光照时间12h/d，温度为25℃。二、结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法，其特征是：包括类原球茎诱导、增殖、分化及生根步骤，其中，类原球茎的诱导、增殖及分化以MS为基本培养基，生根以1/2 MS为基本培养基，加入植物生长调节剂，pH 5.8，液体培养基蔗糖质量百分比浓度为5.0%，固体培养基蔗糖质量百分比浓度为3.0%，类原球茎分化培养基中添加质量含量10%香蕉泥；１）类原球茎诱导：采用液体培养基或固体培养基，液体培养基中含 TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.4 mg/L；固体培养基含TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6‑BA 2.0 mg/L；2）类原球茎增殖：增值培养基中含稀效唑1.5 mg/L + 6‑BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L，其中稀效唑是类原球茎增殖的主要因子；3）类原球茎分化：对类原球茎进行分化培养，10天类原球茎球体顶部开始突起变尖，变绿，60 天后可分化成带有茎节、叶片及幼小毛状根的小苗，分化培养基中含6‑BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L；4）植株生根：分化的幼苗在生根培养基中培养10 d后开始有根长出，生根培养基中含 NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L。...

【技术特征摘要】
1.一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法，其特征是：包括类原球茎诱导、增殖、分化及生根步骤，其中，类原球茎的诱导、增殖及分化以MS为基本培养基，生根以1/2MS为基本培养基，加入植物生长调节剂，pH5.8，液体培养基蔗糖质量百分比浓度为5.0%，固体培养基蔗糖质量百分比浓度为3.0%，类原球茎分化培养基中添加质量含量10%香蕉泥；１）类原球茎诱导：采用液体培养基或固体培养基，液体培养基中含TDZ0.6mg/L+NAA0.4mg/L；固体培养基含TDZ0.6mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L；2）类原球茎增殖：增值培养基中含稀效唑1.5mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，其中稀效唑是类原球茎增殖的主要因子；3）类原球茎分化：对类原球茎进行分化培养，10天类原球茎球体顶部开始突起变尖，变绿，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈常理，金关荣，骆霞虹，唐楠楠，余杨，李珊，程舟，朱关林，
申请(专利权)人：浙江省萧山棉麻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33