荞麦AFLP反应体系的建立方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法。上述荞麦AFLP反应体系的建立方法，通过改进AFLP关键步骤的反应条件，适当地增加了抽提的次数，既将反应液中的杂质去除干净，又减少荞麦DNA机械断裂，提高DNA提取的质量；设置的酶切时间可充分地将荞麦基因组DNA进行酶切；设置的Mg2+浓度既可提高产物特异性DNA的产出率，又避免了非特异性DNA扩增，建立了可靠性好、重复性强、可信度高、方便快速的适用于荞麦的反应体系，只需极少量的DNA样品，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的序列信息。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法。上述荞麦AFLP反应体系的建立方法，通过改进AFLP关键步骤的反应条件，适当地增加了抽提的次数，既将反应液中的杂质去除干净，又减少荞麦DNA机械断裂，提高DNA提取的质量；设置的酶切时间可充分地将荞麦基因组DNA进行酶切；设置的Mg2+浓度既可提高产物特异性DNA的产出率，又避免了非特异性DNA扩增，建立了可靠性好、重复性强、可信度高、方便快速的适用于荞麦的反应体系，只需极少量的DNA样品，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的序列信息。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。【专利说明】荞麦AFLP反应体系的建立方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种荞麦AFLP反应体系的建立方法及其应用。
技术介绍
荞麦是一种粮药兼用的经济作物，其营养成分丰富，富含蛋白质、脂肪酸、维生素和矿物质等，荞麦蛋白具有高生物效价，其氨基酸组成合理，富含8种人体必需氨基酸，尤其是精氨酸、赖氨酸、色氨酸和组氨酸的含量较高，所以荞麦与其他谷类粮食有很好的互补性。荞麦不仅营养全面，而且富含生物类黄酮、多肽、糖醇和D-手性肌醇等高活性药用成分，具有降糖、降脂、降胆固醇、抗氧化、抗衰老和清除自由基等功能，荞麦所含的生物活性成分已引起医学界的广泛关注，并已成为新世纪全球重要的保健食品资源。目前在全球范围内，作物的育种工作面临着由于遗传基础日趋狭窄而导致作物品种适应环境非常脆弱的问题，导致种质资源遭受日益短缺，因此拓宽作物遗传基础已成为当务之急。近年来由于对荞麦营养及药用价值的充分认识，国内外开始加强了对荞麦资源形态、细胞、生化、分子等各个层面的研究和开发工作。扩增片段长度多态性(AFLP)技术以其多态性高、DNA用量少、无需预知基因组序列信息、稳定性好等优点，被认为是最有效的分子标记技术之一，广泛应用于种质资源遗传多样性分析、物种亲缘关系研究、遗传图谱构建、辅助选择育种、品种鉴定、QTL分析等多方面的研究。国内外利用AFLP技术在水稻、玉米、大豆、小麦、谷子等作物的研究上已经广泛应用，但在荞麦上的应用还鲜有报道。`
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种条件优化、专门针对荞麦AFLP反应体系的建立方法，其可靠性好、重复性强、可信度高。本专利技术的另一目的在于提供荞麦AFLP反应体系的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下:将荞麦叶片加入CTAB提取液反应0.5~2小时，抽提，得到模板DNA;将所述模板DNA与内切酶体系混合，在35~38°C下反应I~9小时，得到酶切后的DNA ;其中，所述模板DNA与所述内切酶体系的容量比为I~2:~9:8，所述模板DNA的OD260-280 值为1.8~2.0;将所述酶切后的DNA与连接体系混合，在16~22°C下反应3~10小时，得到连接后的DNA ;其中，所述酶切后的DNA与所述连接体系的容量比为I~2:4~5 ; 将所述连接后的DNA与预扩增体系混合，进行第一次PCR反应，得到预扩增的DNA ；其中，所述连接后的DNA与所述预扩增体系的容量比为3~5:15~17 ;将所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系混合，进行第二次PCR反应，得到扩增后的特异性DNA ;其中，所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系的容量比为3~5:15~17 ;其中，所述选择性扩增体系包含浓度为0.2~1.0mmol/L的第一选择性引物和浓度为0.2~1.0mmol/L的第二选择性引物、浓度为O~3.0mmol/L的含Mg2+盐溶液；其中，所述第一选择性引物和第二选择性引物与含Mg2+盐溶液的容量比为4~6:4~6:5~15。以及，一种上述荞麦AFLP反应体系的建立方法所获得的荞麦特异性DNA在优化引物筛选、荞麦育种、荞麦品种指纹图谱的绘制、荞麦遗传连锁图的构建、荞麦遗传多样性的研究等领域的应用。 上述荞麦AFLP反应体系的建立方法，通过改进AFLP关键步骤的反应条件，适当地增加了抽提的次数，既将反应液中的杂质去除干净，又减少荞麦DNA机械断裂，提高DNA提取的质量；设置的酶切时间可充分地将荞麦基因组DNA进行酶切；设置的Mg2+浓度既可提高产物特异性DNA的产出率，又避免了非特异性DNA扩增，建立了可靠性好、重复性强、可信度高、方便快速的适用于荞麦的反应体系，只需极少量的DNA样品，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的序列信息。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。正是由于上述荞麦AFLP反应体系的建立方法所获得的荞麦特异性DNA绝大部分为显性标记，显示的多态性信息量也很高，非常适合应用在优化引物筛选、荞麦育种、荞麦品种指纹图谱的绘制、荞麦遗传连锁图的构建、荞麦遗传多样性的研究等领域。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术实施例荞麦AFLP反应体系的建立方法工艺流程示意图。图2是本专利技术实施例中酚-氯仿不同抽提次数对基因组DNA的影响的电泳图(其中柱I和柱2为抽提I次的电泳结果；柱3和柱4为抽提2次的电泳结果；柱5和柱6为抽提3次的电泳结果)。图3是本专利技术实施例酶切时间分别为I小时、3小时、5小时、7小时、9小时所获得的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测图。图4是将本专利技术实施例弓丨物E-ACC/M-AC对10份荞麦材料的扩增结果。图 5 是将米用 0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L 浓度的E-GC/M-CCT引物组合进行扩增后得到的特异性DNA，进行琼脂糖凝胶电泳检测的结果图。图 6 是将 Mg2+ 浓度为 0mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L 时的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测的结果图。图7是将预扩增后的DNA不稀释、稀释10倍、20倍、30倍、40倍后，采用E-GC/M-CCT引物组合进行选择性扩增，将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测的结果图。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法。该荞麦的AFLP反应体系的建立方法的工艺流程如图1所示，包括如下步骤:SOl，制备模板DNA:称取荞麦叶片0.2~L Og,加入500~700ul的CTAB提取液反应0.5~2小时，用酚-氯仿液抽提I~3次，得到模板DNA;所述模板DNA的OD26ch28ci值为 1.8 ~2.0 ;S02,酶切模板DNA:将2.0~4.0ul步骤SOl获得的模板DNA与16.0~18.0ul的内切酶体系混合，在35~38°C下反应I~9小时，得到酶切后的DNA ；S03，连接DNA:将5.0~10.0ul步骤S02获得的酶切后的DNA与20.0~25.0ul的连接体系混合，在16~22°C下反应3~10小时，得到连接后的DNA ；S04,预扩增DNA:将3.0~5.0ul步骤S03获得的连接后的DNA与15.0~17.0ul的预扩增体系混合，进行第一次P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法，包括如下步骤：将荞麦叶片加入CTAB提取液反应0.5～2小时，抽提，得到模板DNA;将所述模板DNA与内切酶体系混合，在35～38℃下反应1～9小时，得到酶切后的DNA；其中，所述模板DNA与所述内切酶体系的容量比为1～2：9～8，所述模板DNA的OD260?280值为1.8～2.0；将所述酶切后的DNA与连接体系混合，在16～22℃下反应3～10小时，得到连接后的DNA；其中，所述酶切后的DNA与所述连接体系的容量比为1～2:4～5；将所述连接后的DNA与预扩增体系混合，进行第一次PCR反应，得到预扩增的DNA；其中，所述连接后的DNA与所述预扩增体系的容量比为3～5:15～17；将所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系混合，进行第二次PCR反应，得到扩增后的特异性DNA；其中，所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系的容量比为3～5:15～17；其中，所述选择性扩增体系包含浓度为0.2～1.0mmol/L的第一选择性引物和浓度为0.2～1.0mmol/L的第二选择性引物、浓度为0～3.0mmol/L的含Mg2+盐溶液；其中，所述第一选择性引物、第二选择性引物与含Mg2+盐溶液的容量比为4～6：4～6:5～15。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘韵，侯雅君，李永新，郑文官，陈义昆，唐明辉，
申请(专利权)人：深圳市圣西马生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：