由法医样品回收精子核酸的方法技术

本发明专利技术提供一种由样品中的精细胞选择性回收核酸的方法，所述样品含有至少精细胞和上皮细胞的细胞以及含胞外杂质的细胞悬浮液。所述方法需要将样品加入容器中，隔离细胞和其余样品组分，在隔离之前或之后用洗涤溶液洗涤细胞，从容器中取出含杂质的细胞悬浮液，同时保留细胞；选择性裂解第一种细胞类型的细胞；并由裂解的细胞分离核酸。还提供由第二种细胞类型的细胞回收核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供一种由样品中的精细胞选择性回收核酸的方法，所述样品含有至少精细胞和上皮细胞的细胞以及含胞外杂质的细胞悬浮液。所述方法需要将样品加入容器中，隔离细胞和其余样品组分，在隔离之前或之后用洗涤溶液洗涤细胞，从容器中取出含杂质的细胞悬浮液，同时保留细胞；选择性裂解第一种细胞类型的细胞；并由裂解的细胞分离核酸。还提供由第二种细胞类型的细胞回收核酸的方法。【专利说明】相关申请本申请根据35U.S.C.§ 119(e)要求2007年7月23日申请的美国临时申请号60/961，734的优先权。专利
本专利技术涉及由含有细胞和非细胞杂质的样品中分离细胞并进一步由具体的细胞类型分离核酸的领域。更具体地说，本专利技术涉及以下领域:由样品分离精细胞，所述样品包含胞外杂质和至少一种其它类型的污染细胞(例如上皮细胞)，并由精细胞和非精细胞回收DNA，用于各种目的，包括法医目的。专利技术背景性攻击证据的法医DNA分析经常包括分析精细胞的DNA和诸如上皮细胞的其它细胞的DNA。精细胞一般通过用拭子擦拭粘膜从强奸受害者获得。得自受害者的样品经常包含精子和上皮细胞的混合物。因为上皮细胞可能比样品中的精细胞数目多出至少一个数量级，所以前者可以在纯化精子DNA时引起精细胞DNA污染。因此，经常需要在分析前尽可能干净地分离精细胞和上皮细胞，或精子DNA和上皮细胞DNA。精子和上皮细胞的DNA的分开和分离在由法医标本鉴别攻击者和将攻击者与受害者关联时是必需的步骤。用于由拭子纯化精子的标准方法基于差异提取。精子DNA与受害者DNA的分离去除了不定性，有利于DNA分析，并使得可以更容易地判读出强奸案例中攻击者的DNA谱。尽管差异提取常用于分离精子和上皮细胞，但标准方案是耗时耗力的，在精细胞裂解前需要上皮细胞裂解。 通常，首先重悬浮法医标本中的细胞，之后用含有蛋白酶K和SDS (十二烷基硫酸钠)的溶液选择性消化受害者的上皮细胞。通过离心将完整精子与溶解的污染DNA和上皮细胞碎片分离，小心除去上清液，彻底洗漆精子沉淀(参见例如Giusti等人，J.ForensicSci,31:409-417,1986 ;Gi 11 等人，Nature 318:577-579,1985 ;Wiegand 等人，Int J.LegalMed.，104:359-360,1992 ;和 Yoshida 等人，Forensic Sc1.1nt.,72:25-33,1995)。遗憾的是，离心和小心除去上清液的过程难以自动化，并可能由于多个样品操作步骤而引起精子DNA的损失。在该程序的一个实例中，Gill等人(出处同上)描述了一种由取自性攻击受害者的阴道拭子分离精子DNA的方法。这些拭子包含精子，也包含极大过量的受害者上皮细胞。通过优先裂解(即通过温育在含有SDS和蛋白酶K的缓冲溶液中的细胞混合物)除去上皮细胞和包含在这些细胞中的DNA。精子核不受该处理的影响，因为它们具有二硫键交联的富巯基蛋白，而其它细胞类型被消化，相应的DNA被溶解。在优先裂解后，离心样品，以分离精子核和受害者的溶解的DNA。除去含有受害者DNA的上清液，并重复洗涤精子沉淀。随后通过用含有SDS、蛋白酶K和DTT ( 二硫苏糖醇)的缓冲溶液处理裂解精子核，并通过离心将裂解物与污染细胞分离。对于具有低精子计数的样品，Wiegand等人(出处同上)使用温和裂解条件并取消洗漆步骤尝试改善Gill等人的方法。许多用于分离精细胞和上皮细胞的建议方法基于过滤。Chen等人(J ForensicScience 43:114-118，1998)和Garvin (PCT/US01/01835)在差异裂解前通过重力或温和真空过滤或通过使用可以承受强真空或离心力而孔的大小没有增加的滤器材料分离精子和上皮细胞。然后将DNA和在滤过液中收集的精子分离。差异提取，尤其对精细胞分析而言，如下进行:首先裂解上皮细胞，然后由精子提取DNA。为了减少法医分析的时间，最初需要选择性提取精细胞的DNA。另外，因为选择性上皮细胞裂解条件还引起某些精子裂解，所以在精细胞分离之前裂解上皮细胞减少了样品中存在的精细胞数。需要除去上皮细胞DNA的额外洗涤步骤也促成精细胞的损失。上皮细胞或其它污染细胞类型(如白细胞)的裂解或存在可能妨碍精确的精子分析。在法医样品中存在的来自受损的非精细胞的DNA可以污染细胞(最有可能通过结合精细胞表面)，其可能限制犯罪者的精确鉴定，尤其是在回收的精细胞数低时。本专利技术人发现，尽管存在由异质细胞群中(由各个细胞类型中)差异提取一种核酸类型的技术，但残留的污染核酸仍是保证更精确的提取方法的问题。其中对高度特异性的差异提取存在需要的一种应用是法医，具体地说是性攻击分析。因为其易碎性，所以性攻击样品中的上皮细胞和其它细胞(例如白细胞)经常在操作、样品处理或储存过程中破碎和裂解。这种残留DNA如果没有除去，则可能在选择性精子裂解过程中污染雄性DNA，尤其是在精细胞数低时。另外，上皮细胞和精细胞表面是高度功能化的，其表面带有被通过离子相互作用以及其它非共价方法结合核酸的分子(例如糖蛋白)。已发现这些细胞表面蛋白结合 样品中存在的胞外核酸。专利技术概述本专利技术通过在精细胞裂解前实施新的洗涤步骤从而减少法医样品中存在的残留DNA和污染细胞(例如白细胞)的数量。除了基于粒子或珠的方法以外，本专利技术可以使用经典的离心方法、大小排阻过滤分离样品中的细胞。本专利技术方法容易改良以适用已有设备例如Beckman Biomek?(Beckman Coulter, Fullerton, CA)或 Tecan 液体自动化操作系统(例如 Freedom EvO?Services TecanSystems, San Jose, CA)的自动化和高通量检测。本专利技术可更广泛地应用于法医和其它环境，在所述环境中，必须由一种细胞类型以上的混合物中存在的一种细胞类型分离核酸，只要每种细胞类型可被选择性裂解(除了不需要被选择性裂解的最后剩下的细胞类型以外)。在一个方面，本专利技术涉及在含有混合的精细胞和上皮细胞的样品以及含有杂质的细胞悬浮液中选择性回收精细胞DNA的方法。所述杂质包括污染的残留DNA和可能存在的其它污染细胞，例如白细胞。在该方面，所述方法需要在第一个分离步骤中分离悬浮液中的混合细胞，选择性裂解精细胞，并由精细胞回收DNA。所述方法还包括两个额外的步骤中的至少一个，其中第一个步骤是用第一种洗涤溶液洗涤样品，所述第一种洗涤溶液在第一个分离步骤之前解离或消化细胞表面的残留DNA。第二个步骤包括洗涤/分离程序，其包括在第二个分离步骤中用第二种洗涤溶液洗涤分离的混合细胞，接着分离洗涤的混合细胞和第二种洗涤溶液，之后实施裂解步骤。如果在样品中存在白细胞，则第一种或第二种洗涤溶液选择性裂解白细胞。应当指出的是，因为可能不进行第二个分离步骤(在此情况下在第一个分离步骤之后没有洗涤步骤)，所以在所述方法中可以仅有一个分离步骤。本专利技术人发现，这种简单的一次或多次洗涤有效减少了残留DNA污染的问题，使得不干扰基因分型，而不需要可能引入其它问题的昂贵的、耗时的或操作性的步骤。又一方面，通过大小排阻过滤、离心或用磁性粒子分离细胞。另一方面，提供一种用于在含有混合的精细胞和上皮细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·刘，
申请(专利权)人：应用生物系统有限责任公司，
类型：
国别省市：