本发明专利技术涉及用于扩增靶核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩增产物，有时叫作次级扩增产物或假的副产物，的组合物、方法和试剂盒。本发明专利技术公开的酶抑制剂包括核苷酸序列和至少一种猝灭剂。本发明专利技术还提供包括与酶缔合的酶抑制剂的复合物，其中所述酶的至少一种酶促活性被抑制。本发明专利技术公开了用于扩增靶核酸同时减少不需要的扩增产物的方法，其是减少非特异性荧光的方法。本发明专利技术还提供了迅速进行某些公开的方法的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒本申请是申请日为2006年9月29日、申请号为“200680043159.5”、题为“用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒”的中国专利申请的分案申请。领域本专利技术一般涉及用于扩增核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩增产物的组合物、方法和试剂盒。介绍尽管聚合酶链式反应(PCR)及相关的技术对于各种应用是高度有用的，但是由于不理想的副反应而引起的非靶核酸的扩增可能存在显著的问题。这样的副反应可以作为非靶核酸的错误引发和/或引物寡聚化(有时也叫作引物二聚体形成)，以及这些引发的假体(artifacts)的后续扩增的结果而发生。在使用具有显著的背景核酸而靶核酸以低拷贝数存在的核酸混合物进行PCR的应用中，这是特别实际的(参见，例如，Chou等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992))。非特异性扩增产物的产生已经至少部分归因于延长非特异性退火的引物 的环境温度下的DNA聚合酶活性(参见，例如，id.；Li等，Proc.Natl.Acad.Sc1.(美国国家科学院学报)87:4580 (1990))。因此，在环境温度下抑制DNA聚合酶的活性有利于控制次级扩增子的产生。已经描述了一些技术，据说其减少不需要的次级扩增产物的形成。按照某些“手工热启动”技术，直到混合物的温度足够高足以防止非特异性引物退火时才加入对DNA聚合酶活性重要的成分(例如，二价离子和/或DNA聚合酶本身)到反应混合物中(参见，例如，Chou 等,Nucl.Acids Res.(核酸研究)20:1717-1723 (1992);和 D’Aquila 等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)19:3749 (1991))。较少劳动力-密集型技术应用扩增反应的至少一种成分的物理分离或可逆失活。例如，镁或DNA聚合酶可以隔离在蜡珠中，当反应温度升高时蜡珠熔化，只在升高的温度释放所隔离的成分。按照其它的技术，对DNA聚合酶进行可逆地失活或修饰，例如，通过DNA聚合酶的可逆的化学修饰或与抗体的结合(参见，例如，Birch等，美国专利号5，677，152)。在升高的反应温度，所述化学修饰被逆转，或者所述抗体分子变性，释放出功能性DNA聚合酶。然而，一些这样的技术似乎是有漏洞的，原因在于在更低的反应温度，一些DNA聚合酶活性是可检测到的，或者它们需要将反应混合物延长暴露于高温才能完全使得DNA聚合酶失活。某些目前所用的核酸扩增技术包括检测和/或定量扩增产物的步骤，其包括核酸染料，例如但不限于，SYBR Green I (分子探针(Molecular Probes), Eugene, OR),包括某些实时和/或终点检测技术(参见，例如，Ririe等，Analyt.Biochem.(分析生物化学)245 =154-60 (1997))。典型地，所述核酸染料与扩增产物的双链片段和/或引物_模板双链体缔合，并且在特别的核酸染料所特有的波长发射可检测的荧光信号。某些扩增方法包括评估扩增产物的纯度的检测步骤，其包括核酸染料，例如但不限于，PCR后解离曲线分析，其也叫作解链曲线分析。由于扩增子的解链曲线特别取决于它的长度和序列，所以扩增子通常可以通过它们的解链曲线而区分(参见，例如，Zhang等，Ifepatology(肝脏病学)36:723-28(2002))。解离或解链曲线可以在特定的扩增反应过程中当反应温度经过所述扩增子的解链温度时通过检测核酸染料的荧光而获得。双链扩增子的解离观察为在所述核酸染料特征性发射波长的荧光的突然减少。按照某些解离曲线分析技术，当解链曲线表现出单一的、一致的解链温度时，有时在荧光强度的负导数相对温度(-dF/dt相对T)的图上绘图性表示为一个峰，那么将扩增产物分类为“纯的”。例如，在来自单丛扩增的这样的解离曲线中出现多个峰典型地表明存在不需要的副反应产物。当应用这样的基于核酸染料的扩增产物检测技术时，通常理想地:1)至少减少并且优选地消除不需要的副反应产物的形成，和2)至少减少并且优选地消除由其它核酸，即非扩增产物的双链片段的变性导致的荧光峰。除此之外，由于引物、连接探针、裂解探针、启动子-引物等的非特异性退火，以及随后在亚最佳温度的酶活，某些其它扩增技术也可以产生不需要的扩增产物。例如，尽管反应成分通常是室温下结合，或者尽管反应组合物被加热到需要的反应温度。这些技术中至少有一些可以受益于背景荧光的减少。专利技术概述本专利技术涉及用于扩增靶核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩增产物的组合物、方法和试剂盒，所述不需要的扩增产物在本领域中有时叫作次级扩增子或假性副产物。本专利技术公开了包括核苷酸序列和猝灭剂的酶抑制剂。所述公开的抑制剂设计成抑制酶的至少一种酶活性。在某些实施方案中，所述酶抑制剂的核苷酸序列包括适体。在一些实施方案中，酶抑制剂包括能够形成至少一个双链片段的适体(参见，例如，Yakimovich 等,Biochem.(Mosc.)(生物化学(莫斯科))68(2):228-35(2003) ;Nickens 等,RNA9:1029-33(2003) ;Nishikawa 等，Oligonucleotides (寡核苷酸)14:114-29(2004);和Umehara等，J.Biochem.(生物化学杂志)137:339-74 (2005))。在一些实施方案中，酶抑制剂包括多样的不同的猝灭剂。在某些实施方案中，所述酶抑制剂可以呈现出一种构象，所述构象在第一温度包括至少一个双链片段，但是当加热到第二温度时，是单链的或基本上单链的。按照某些实施方案，包括至少一个双链片段的酶抑制剂可以与下列各项中的至少一种形成复合体=DNA聚合酶 ，包括但不限于反转录酶；RNA聚合酶；裂解酶，包括但不限于，结构-特异的核酸酶；解旋酶；和连接酶。在某些实施方案中，酶抑制剂是相对应的酶的无效底物，原因在于所述抑制剂包括封闭基团、核苷酸类似物、不可裂解的核苷酸间连接或它们的组合。本专利技术公开了包括核苷酸序列和猝灭剂的DNA聚合酶抑制剂。一些DNA聚合酶抑制剂包括两种或多种猝灭剂，其可以是相同的猝灭剂或不同的猝灭剂。在某些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂还包括小沟结合物，其在一些实施方案中包括猝灭剂。在一些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂的核苷酸序列的3’-端不能被DNA聚合酶延伸，这典型地是由于封闭基团或非延伸核苷酸的存在。在一些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂的核苷酸序列包括能够形成至少一个双链片段的适体(参见,例如,Yakimovich等,Biochem.(Mosc.)(生物化学(莫斯科))68(2):228-35(2003))。本专利技术提供包含酶和酶抑制剂的复合物。某些复合物包含:DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制剂；连接酶和连接酶抑制剂；RNA聚合酶和RNA聚合酶抑制剂；裂解酶和裂解酶抑制剂；或解旋酶和解旋酶抑制剂。某些复合物还包含脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，核苷酸类似物，辅助蛋白，例如但不限于单链结合蛋白(SSB)或增殖细胞核抗原(PCNA)，或它们的组合。典型地，所述酶-酶抑制剂复合物可以在第一温度形成，并且当与在所述复合物中的抑制剂缔合时，所述酶的至少一种催化活性被抑制。当将所述复合物加热本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶抑制剂，所述酶抑制剂包含核苷酸序列和至少两种不同的猝灭剂，其中所述核苷酸序列包含至少一个双链片段。
【技术特征摘要】
2005.10.03 US 60/723，3831.一种酶抑制剂，所述酶抑制剂包含核苷酸序列和至少两种不同的猝灭剂，其中所述核苷酸序列包含至少一个双链片段。2.一种包含酶和权利要求1的酶抑制剂的复合物。3.权利要求2的复合物，其中所述酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，解旋酶，裂解酶，或它们的组合。4.权利要求3的复合物，其中所述酶是聚合酶并且所述酶抑制剂是聚合酶抑制剂。5.权利要求4的复合物，所述复合物还包含NTP，核苷酸类似物，或NTP和核苷酸类似物。6.权利要求5的复合物，其中所述聚合酶抑制剂不可通过所述聚合酶延伸。7.权利要求4的复合物，其中所述聚合酶抑制剂的核苷酸序列包括适体。8.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其中所述酶抑制剂的核苷酸序列包含核苷酸类似物。9.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其中所述酶抑制剂的核苷酸序列包含第一区域、第二区域、第三区域和任选第四区域；并且其中所述第一区域与所述第三区域互补。10.权利要求9的酶抑制剂或复合物，其中所述第一区域、所述第三区域或所述第一区域和第三区域包含至少一个核苷酸类似物；并且其中所述第一区域包含第一猝灭剂而所述第二区域包含第二猝灭剂，并且任选地，所述第一猝灭剂和第二猝灭剂是不同的。11.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其还包括小沟结合...
【专利技术属性】
技术研发人员：董守连，琼科·史蒂文斯，丹尼·H·李，
申请(专利权)人：应用生物系统有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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