一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用技术

本发明专利技术公开一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用，主要步骤包括：以草地早熟禾的种子苗茎尖为材料，离体培养诱导茎尖基部膨大，切取膨大组织转入继代及成丛培养基上诱导丛生芽发生。在继代及成丛培养基上丛生芽块持续增殖，转入成苗培养基和生根培养基后产生完整植株。取适宜生长期的丛生芽块为受体采用基因枪轰击法或农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因植株。在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Ｓｉｌｗｅｔ　　Ｌ－７７处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的早熟禾转基因技术体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种早熟禾遗传转化体系的方法及应用，属于农业生物
或植物基因工程领域。
技术介绍
草地早熟禾(Poa pratensis L.)属冷季型草坪草，是温带地区重要的草种之一。由于它具有色美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点，在我国北方地区多被用作建坪草种之一。草地早熟禾亦有自身的缺点，如易受病虫危害，不耐炎热，耐高低温能力差，抗旱力不强等。这些性状在一定程度上都可以通过基因转化的手段得到改良。成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。1985年，Vasil在国际草原学大会上第一次提出利用遗传转化技术将其他来源的特定基因导入牧草的可行性，为应用基因工程技术改良牧草，包括提高产量和利用率、增加牧草的抗逆性等奠定了理论基础。通过基因工程技术培育出各种优质高产的牧草和草坪草新品种，对促进无污染绿色养殖业和绿色畜产品的发展以及我国西部地区生态环境建设都会产生深远的影响。早熟禾遗传转化体系建立的难度较大，主要是由于已有的早熟禾组织培养和植株再生体系不能满足转基因的需要。草地早熟禾的组织培养，国内外主要集中于愈伤组织诱导及其分化方面。早在1984年，McDonnel等以早熟禾(Kentucky bluegrass)成熟胚为外植体，诱导出愈伤组织并再生植株。1986年，Boyd等也报道了以早熟禾成熟胚为材料诱导愈伤组织和植株再生的工作。1988年，Van der Valk等报道了以早熟禾花序为外植体诱导植株再生和以成熟胚为材料诱导愈伤组织的工作。同年，Van der Valk等还报道了建立草地早熟禾的原生质体悬浮培养体系并获得白化苗工作。1989年，Van der Valk等报道了以花序和成熟种子为外植体建立草地早熟禾再生体系，发现花序比成熟种子更易于形成胚性愈伤组织。1991年，Van Ark等也报道了早熟禾成熟胚培养及愈伤组织诱导等工作。1993年，Nielsen等从早熟禾的胚性悬浮细胞再生出绿色植株。1994年，朱根发等以草地早熟禾胚轴及幼穗为外植体，研究了其培养条件和分化能力，发现草地早熟禾成熟胚愈伤组织的胚胎发生能力很差，胚轴也很难诱导出具较高分化能力的愈伤组织，二者均不是理想的外植体；而从幼穗中可以诱导出胚性愈伤组织。1995年，Van derValk等以成熟种子为外植体诱导愈伤组织，发现含有6-BA(6-苄基嘌呤) 的培养基的诱导频率要高于不含6-BA的，不同品种间的诱导率相差很大，通过混合使用2，4-D(2，4--二氯苯氧乙酸)和6-BA可大幅度提高体细胞胚和植株的再生率。同年，Griffia等报道了从早熟禾种子产生的愈伤组织可高频率再生植株，但愈伤组织经过继代培养后植株再生频率迅速下降。1996年，Ke等报道了早熟禾盾片培养再生植株的工作。2003年，佘建明等报道了在继代培养中，早代选择外表呈干燥、紧密、颗粒状的愈伤组织能有效地克服随着继代培养时间的延长愈伤组织再生植株的能力显著下降这一障碍。朱根发等人工作中以幼穗为外植体虽诱导率能达到100％(朱根发等，1994)，但由于取材受季节限制，所以很多人仍采用种子胚为外植体诱导愈伤组织。由于草地早熟禾成熟胚的愈伤组织分化频率偏低和胚性愈伤组织难于继代培养等原因，从而影响了草地早熟禾转基因工作的开展。直到1999年，马忠华等以早熟禾成熟种子为外植体，初步建立了早熟禾的基因转化体系，获得了转抗生素抗性基因的植株。相对于其它植物的遗传转化研究，早熟禾转基因工作仍处在探索阶段。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术以草地早熟禾的种子苗茎尖为试验材料，诱导其基部愈伤化膨大，切取膨大组织，放在继代及成丛培养基上诱导发生丛生芽，丛生芽在继代及成丛培养基上持续增生，提供转基因的受体材料。采用基因枪轰击法或农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在此基础上，确立了在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L-77处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的早熟禾转基因技术体系。本专利技术中，茎尖是指十到几十微米的茎尖分生组织(shoot meristem)和大到几十毫米的茎端(shoot tip)；而茎尖分生组织是指顶端生长锥及其邻近的叶原基。丛生小芽是指离体培养茎尖基部膨大组织在继代培养基上产生的丛生小芽及其继代培养物。丛生芽块是指离体培养的丛生小芽和未组织化的分裂细胞构成的组织块及其继代培养物。本专利技术中，转基因受体是指茎尖离体培养产生的丛生芽块及其扩增和继代培养物。本专利技术中，农杆菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介导的遗传转化程序基本上同石田(Ishida，1996)等报道的。在转染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚类化合物、表面活性剂Silwet L-77(浓度为0-0.3％)和中性单糖(葡萄糖、木糖)，丛生芽块放在悬浮农杆菌的转染液中，在0.95-0.10个大气压(0.95×105Pa-1×104pa)下浸染3-18分钟，然后在培养基上共培养2-15天。转化体在含有适宜抗生素的培养基上抑菌，在加有合适浓度选择剂的培养基上筛选，然后在继代及成丛培养基上分化小苗。本专利技术中，基因枪轰击法(particle bomrdment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞中的一种遗传转化技术。最初是美国康乃尔大学萨伏特(Sanford)等研制成功的火药基因枪及转化技术，此后有不同学者研制出的多种基因枪及不断改进的转化技术。本专利技术研究中所用的基因枪为美国Bio-RAD公司产品，型号为Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System，按使用说明书操作。轰击参数为可裂圆片与载体的距离为2.5厘米，载体与阻挡网的距离为0.8厘米，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在3-9厘米间取值。本专利技术中，基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。本专利技术中所用培养基有基本培养基为改良MS培养基(KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，FeSO4·7H2O27.8mgL-1，ZnSO4·7H2O 10mgL-1，MnSO4·4H2O 22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI0.83mgL-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mgL-1，CuSO4·5H2O 0.025mgL-1，CoCl2·6H2O 0.025mgL-1，盐酸硫胺素10.0mgL-1，盐酸吡哆醇1.0mgL-1，烟酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，酪蛋白水解物500mgL-1)，蔗糖30gL-1，琼脂粉6.5gL-1，pH5.8-6.0。该培养基用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。诱导培养基附加不同植物生长调节物质(激素)组合的基本培养基。对于多数早熟禾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立早熟禾转基因受体体系的方法，其特征在于：①种子萌发小苗的茎尖离体培养和基部膨大组织的诱导及培养基，②培养茎尖基部膨大组织诱导丛生芽及培养基，③丛生芽块继代培养，④以丛生芽块为受体进行遗传转化及受体组织继代培养时间和转化参数； 所述的转基因受体体系是指茎尖离体培养产生的丛生芽块及其扩增和继代培养物；丛生芽块是指离体培养茎尖在含有２，４－Ｄ（２，４－二氯苯氧乙酸）和６－ＢＡ（６－苄基嘌呤）的培养基上产生的由丛生小芽和未组织化细胞组成的组织块及其继代培养物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张举仁，杨爱芳，张可炜，尹小燕，谷晓峰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]