一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物催化甘油产1，3‑丙二醇的方法。该方法先通过甘油脱水酶将甘油转化为中间体3‑羟基丙醛，中间体在NAD类似物依赖型1，3‑丙二醇脱氢酶与可再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶偶联催化下，还生产1，3‑丙二醇。该体系可用于胞外无细胞体系或在微生物体内催化生物柴油副产物甘油产1，3‑丙二醇，显著降低1，3‑丙二醇生产成本，提高产物得率。

A biocatalytic method for the production of 1,3-propanediol from glycerol

【技术实现步骤摘要】
一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物依赖型氧化还原酶催化甘油产1，3-丙二醇的方法，具体地说，是通过甘油脱水酶将甘油转化为3-羟基丙醛，再在NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶与再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶偶联催化下，将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。此催化体系可在体外或在微生物体内催化甘油产1，3-丙二醇。
技术介绍
1，3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是重要的化工原料，除了用于粘合剂、防冻剂、增塑剂、洗涤剂、防腐剂等合成，还可用于食品、化妆品和制药等行业，其最广泛的应用是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯合成的单体，其中以其为单体的聚对苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(PTT)具有优良的物理化学性能，进一步加工后的材料可应用于纺织、薄膜材料、包装等工业。1,3-丙二醇的生产主要有化学法和生物法。化学合成法反应条件苛刻，对设备要求高，有害气体排放，增加了环境成本，催化剂以及毒性中间体残留等问题很大程度上限制了1，3-丙二醇在食品和医药等方面的应用；而生物法以其廉价可再生的原料，更环保的工艺过程，受到更加广泛的认可，具有更广阔的发展前景。甘油作为生物柴油生产的副产物，其高值化利用成为生物柴油成本控制的关键问题之一，因此，甘油生物催化转化产1，3-丙二醇具有重要的应用意义。目前，除Dupont和Genencor公司用葡萄糖为底物外(US7067300，US6514733)，德国生物技术研究中心，我国清华大学、大连理工大学、华侨大学、江南大学、北京化工大学、上海理工大学等相继开发了以甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇的酶，方法或菌株。仅从优化微生物发酵，多产，联产的思路产1，3-丙二醇菌达到或接近理论得率，仍然存在产物浓度不高、甘油转化率低、生产强度低等问题，如何突破这一瓶颈，提高生物法1，3-丙二醇工业化生产的竞争力，具有重大的现实意义。以高甘油浓度耐受性的克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)为代表发酵产1，3-丙二醇备受关注，因此菌株与大肠杆菌在生化特性上的相似性，为菌株的基因改良和代谢通路的重建提供了可能。克雷伯氏杆菌厌氧发酵产1，3-丙二醇的途径涉及氧化和还原两条途径。氧化途径中，甘油经甘油脱氢酶(GDH)催化生成二羟丙酮(DHA)，然后进一步转化为丙酮酸，产生ATP和NADH以及乙酸等代谢副产物，伴随菌体生长；而还原途径主要分为两步反应：(1)甘油脱水酶(glyceroldehydratase，GDHt)将甘油脱水为中间体3-羟基丙醛(3-hydoxypropionaldehyde,3-HPA)；(2)1，3-丙二醇脱氢酶(1,3-propanedioldehydrogenase,PDOR,https://www.rcsb.org/structure/3bfj,PDBID3BFJ)在辅酶NADH的作用下，催化3-HPA转化为1，3-丙二醇。研究表明，由于反应步骤(2)是限速步骤，因此，在工程菌发酵过程中，当底物浓度较高时，会积累大量的毒性中间体3-HPA(Barbirato,F.etal.,Appl.Environ.Microbiol.1996,62,1448)，与菌体本身产生的酸性物质一起，抑制PDOR的活性，而PDOR活性下降又促使3-HPA的进一步积累，形成恶性循环导致微生物产1，3-丙二醇停止；另一方面，发酵液中的1，3-丙二醇也会反馈抑制PDOR活性。因此，PDOR是生产1，3-丙二醇的关键酶，仅在菌体过表达PDOR也无法得到预期效果(Zheng,P.etal.,ProcessBiochem.2006,41,2160)，因为此步反应需要消耗化学当量的辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，但由于胞内很多氧化还原酶共享利用NADH或NADPH作为辅酶，可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。然而，任何改变NAD浓度及其NAD(P)/NAD(P)H比例的操作都会对细胞产生胞内全局性影响(Holm,A.K.etal.,J.Biol.Chem.2010,285,17498)，因此，很难从辅酶水平对生物体系中与1，3-丙二醇相关的氧化还原酶进行调控。虽然，改变PDOR辅酶偏好性(由NADH到NADPH)可一定程度提高1，3-丙二醇的产量(CN200810228269.X)，但NADPH仍是胞内通用辅酶，1，3-丙二醇的产量很难从根本上加以提高。本专利技术中以生物兼容小分子为辅因子再生底物，生物正交NADH类似物传递还原力，由于类似物只被突变型氧化还原酶识别(包括PDOR以及再生NAD类似物的氧化还原酶)，即该系统可独立于细胞发挥作用，可在未对系统辅酶水平扰动的情况下，提高1,3-丙二醇的产量，实现生物催化转化甘油产1，3-丙二醇。
技术实现思路
本专利技术涉及一种产1，3-丙二醇的方法，具体来说，是通过甘油脱水酶将甘油转化为中间体3-羟基丙醛，在NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶与可再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶耦联催化下，将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。因此，本专利技术的方法可应用于生物催化转化制备1，3-丙二醇领域，具有重要价值和应用前景。一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：在缓冲体系中，以NAD类似物为介导，甘油脱水酶和维生素B12，以及1，3-丙二醇脱氢酶PDOR催化下，以甘油为原料生产1，3-丙二醇。所述1，3-丙二醇脱氢酶PDOR基因来源于克雷伯氏菌属，具有SEQIDNO：1的基因序列，相应的蛋白质具有SEQIDNO：2的氨基酸序列；NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR包括但不限于如下多位点突变PDOR-G43K/G186P/L191F(其中，PDOR代表酶名称-第43位甘氨酸突变为赖氨酸，第186位甘氨酸突变为脯氨酸，第191位亮氨酸突变为苯丙氨酸，其他同理)，PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y，PDOR-T142C/G186P，PDOR-T143I/G186P，PDOR-G183M/K187N，PDOR-T142C/G186W，PDOR-L44N/T143Y/G187R/，PDOR-L44N/T142K/L191C，PDOR-L44N/T142K/L191G，或PDOR-L44N/T142K/L191G中的一种或两种以上；本专利技术涉及的NAD类似物包括NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、NGD、NTD、NUD，它们具有如下的化学结构：本专利技术涉及的NAD类似物保留了NAD氧化还原功能结构，上述类似物结构为氧化态称为NAD类似物，而相应的还原态具有1,4-二氢烟酰胺单核苷酸结构，称为NADH类似物。NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强吸收，摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1(JiDB,etal.Creationofbioorthogonalredoxsystemsdependingonnico本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：在缓冲体系中，以NAD类似物为介导，甘油脱水酶、维生素B

【技术特征摘要】
1.一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：在缓冲体系中，以NAD类似物为介导，甘油脱水酶、维生素B12、NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR、再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶、再生底物存在下，以甘油为原料生产1，3-丙二醇。


2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1，3-丙二醇脱氢酶PDOR基因来源于克雷伯氏菌属，具有SEQIDNO：1的基因序列，其编码的蛋白质具有SEQIDNO：2的氨基酸序列；
NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR为包括但不限于如下：PDOR多位点突变PDOR-G43K/G186P/L191F，PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y，PDOR-T142C/G186P，PDOR-T143I/G186P，PDOR-G183M/K187N，PDOR-T142C/G186W，PDOR-L44N/T143Y/G187R/，PDOR-L44N/T142K/L191C，PDOR-L44N/T142K/L191G，或PDOR-L44N/T142K/L191G中的一种或两种以上。


3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述NAD类似物为NCD，NFCD，NClCD，NBrCD，NMeCD，NGD，NTD和NUD中的一种或两种以上，具体结构式如下：





4.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述用于再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶，为可催化还原NAD类似物为NADH类似物的突变活性蛋白质包括但不局限于：亚磷酸脱氢酶，苹果酸酶，乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，甲醛脱氢酶，或甲醇脱氢酶中的一种或两种以上；
所述再生NAD类似物的氧化还原酶对应再生底物包括但不限于亚磷酸化合物，苹果酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物，甲醛，甲醇，乙醇，丙醇或丁醇中的一种或两种以上；
其中，亚磷酸化合物为亚磷酸，亚磷酸盐，氘代亚磷酸或氘代亚磷酸盐中的一种或两种以上；
苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐、氘代苹果酸、氘代苹果酸盐中的一种或两种以上；
甲酸化合物为甲酸，甲酸盐，氘代甲酸或氘代甲酸盐中的一种或两种以上；
D-乳酸化合物为D-乳酸，D-乳酸盐，氘代D-乳酸或氘代D-乳酸盐中的一种或两种以上。


5.按照权利要求4所述的方法，其特征还在于：所述经过突变可再生NAD类似物的氧化还原酶突变体为：
亚磷酸脱氢酶突变体包括但不限于psPDH，psPDH-L151V/D213Q，rsPDH，rsPDH-I151R，rsPDH-I151R/E213C或rsPDH-I151R/I218F中的一种或两种以上；苹果酸酶突变体包括但不限于ME-L310R/Q401C，ME-L310R中的一种或两种；乳酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，刘武军，郭潇佳，刘玉雪，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21