一种鲨肌醇的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇制备鲨肌醇的方法，包括构建表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和/或耐热鲨肌醇脱氢酶基因的工程菌，并将工程菌进行细胞膜通透性处理和/或破碎，然后利用透性工程菌或其裂解液将肌肉肌醇转化为鲨肌醇。本发明专利技术的方法与现有生产鲨肌醇的方法相比，具有生产工艺简单、生产成本低、产率高等优点。

A preparation method of squarinitol

【技术实现步骤摘要】
一种鲨肌醇的制备方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种鲨肌醇的制备方法，具体涉及一种利用微生物全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇将其转化为鲨肌醇的方法。
技术介绍
鲨肌醇(scyllo-inositol，简称SI)是肌肉肌醇(myo-inositol，MI)的一种差向异构体(图1)，存在于植物、动物和一些细菌中，但其在自然界中的含量远远低于肌肉肌醇。研究表明，鲨肌醇具有淀粉样β蛋白聚集抑制作用，可调节肌肉肌醇依赖的中枢神经信号，是治疗阿兹海默氏病的一种潜在的药物，目前已由TransitionTherapeuticsIrelandLimited公司进行临床试验；同时可以改善唐氏综合征人群的认知水平。此外，鲨肌醇可以降低尿酸水平，用来治疗高尿酸血症。在传统的合成方法中，鲨肌醇主要是通过以肌肉肌醇为原料经过复杂的步骤采用化学方法合成，然而该方法需要羟基的保护和脱保护，步骤繁琐，不利于规模化生产。近年来，随着生物工程技术的发展，生物法制备鲨肌醇成为新的发展趋势。目前已报道了利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的细胞工厂来生产鲨肌醇(YamaokaM,OsawaS,MorinagaT,TakenakaS,YoshidaK-i(2011)AcellfactoryofBacillussubtilisengineeredforthesimplebioconversionofmyo-inositoltoscyllo-inositol,apotentialtherapeuticagentforAlzheimer'sdisease.MicrobialCellFactories10；TanakaK,TajimaS,TakenakaS,YoshidaK-i(2013)AnimprovedBacillussubtiliscellfactoryforproducingscyllo-inositol,apromisingtherapeuticagentforAlzheimer'sdisease.MicrobialCellFactories12；TanakaK,TakanakaS,YoshidaK-i(2014)Asecond-generationBacilluscellfactoryforrareinositolproduction.Bioengineered5(5):331-334；TanakaK,NatsumeA,IshikawaS,TakenakaS,YoshidaK-i(2017)Anew-generationofBacillussubtiliscellfactoryforfurtherelevatedscyllo-inositolproduction.MicrobialCellFactories16)。该方法需要复杂的代谢流控制，同时鲨肌醇的产率依赖于培养基的营养物质，无疑增加了工艺的复杂性。因此，亟待开发一种生产工艺简单、产率高、低成本地制备鲨肌醇的新方法。
技术实现思路
针对现有的制备鲨肌醇的方法所存在的问题，本专利技术提供一种利用表达肌肉肌醇脱氢酶(myo-inositol2-dehydrogenase，EC1.1.1.18，简称IDH)和鲨肌醇脱氢酶(scyllo-inositol2-dehydrogenase，EC1.1.1.370，简称SIDH)的全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇生产鲨肌醇的方法。该方法具有生产工艺简单、生产成本低、产率高等优点。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种制备鲨肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：(1)构建共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的工程菌、和/或分别表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的工程菌；(2)将步骤(1)构建的工程菌进行发酵获得全细胞；(3)将步骤(2)获得的全细胞进行细胞膜通透性处理和/或破碎，获得透性全细胞和/或裂解液；(4)利用步骤(3)获得的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液的混合物，和/或共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备鲨肌醇。根据本专利技术，所述催化途径包括：由耐热肌肉肌醇脱氢酶在NAD+存在下将底物肌肉肌醇氧化为中间体肌醇单酮；由耐热鲨肌醇脱氢酶在NADH存在下将中间体肌醇单酮还原为产物鲨肌醇，如图2所示。在本专利技术的催化途径中，所需NAD+来自于所述工程菌细胞，即，本专利技术的方法不包括额外添加NAD+的步骤。优选地，根据本专利技术，步骤(1)中，所述工程菌包含共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的载体、或者同时包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的载体、或者包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体、或者包含表达耐热鲨肌醇脱氢酶的载体。本领域技术人员可以理解，本专利技术所涉及的载体和工程菌可以通过本领域已知的常规方法制备，例如，通过重组DNA技术构建，获取肌肉肌醇脱氢酶的编码基因iolG和鲨肌醇脱氢酶的编码基因iolX，构建重组表达载体，转入宿主菌获得基因工程菌。优选地，根据本专利技术，步骤(1)中，“耐热肌肉肌醇脱氢酶”指在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将肌肉肌醇氧化为肌醇单酮功能的酶。进一步优选地，所述耐热肌肉肌醇脱氢酶来源于嗜热微生物，例如嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、Pseudothermotogathermarum等；或所述耐热肌肉肌醇脱氢酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热肌肉肌醇脱氢酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述耐热肌肉肌醇脱氢酶来源于Geobacilluskaustophilus；或所述耐热肌肉肌醇脱氢酶的氨基酸序列与来源于Geobacilluskaustophilus的耐热肌肉肌醇脱氢酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。优选地，根据本专利技术，步骤(1)中，“耐热鲨肌醇脱氢酶”指在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将肌醇单酮还原化为鲨肌醇功能的酶。进一步优选地，所述耐热鲨肌醇脱氢酶来源于嗜热微生物，例如嗜热地芽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备鲨肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：/n(1)构建共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的工程菌、和/或分别表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的工程菌；/n(2)将步骤(1)构建的工程菌进行发酵获得全细胞；/n(3)将步骤(2)获得的全细胞进行细胞膜通透性处理和/或破碎，获得透性全细胞和/或裂解液；/n(4)利用步骤(3)获得的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液的混合物，和/或共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备鲨肌醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备鲨肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)构建共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的工程菌、和/或分别表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的工程菌；
(2)将步骤(1)构建的工程菌进行发酵获得全细胞；
(3)将步骤(2)获得的全细胞进行细胞膜通透性处理和/或破碎，获得透性全细胞和/或裂解液；
(4)利用步骤(3)获得的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液的混合物，和/或共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的全细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备鲨肌醇。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌包含共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的载体、或者同时包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的载体、或者包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体、或者包含表达耐热鲨肌醇脱氢酶的载体。
优选地，所述耐热肌肉肌醇脱氢酶为在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将肌肉肌醇氧化为肌醇单酮功能的酶。进一步优选地，所述耐热肌肉肌醇脱氢酶来源于嗜热微生物或所述耐热肌肉肌醇脱氢酶的氨基酸序列与来源于嗜热微生物的耐热肌肉肌醇脱氢酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述嗜热微生物选自嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、Pseudothermotogathermarum。
优选地，所述耐热鲨肌醇脱氢酶为在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将肌醇单酮还原为鲨肌醇功能的酶。进一步优选地，所述耐热鲨肌醇脱氢酶来源于嗜热微生物或所述耐热鲨肌醇脱氢酶的氨基酸序列与来源于嗜热微生物的耐热鲨肌醇脱氢酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述嗜热微生物选自嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、Geobacillusthermoleovorans、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)。
优选地，所述共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热鲨肌醇脱氢酶的载体包括第一启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、第一终止子、第二启动子、耐热鲨肌醇脱氢酶基因和第二终止子，或者包括第一启动子、耐热鲨肌醇脱氢酶基因、第一终止子、第二启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因和第二终止子，或者包括启动子、耐热鲨肌醇脱氢酶基因、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、终止子，或者包括启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、热鲨肌醇脱氢酶基因、终止子；所述表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体包括启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、终止子；所述表达耐热鲨肌醇脱氢酶的载体包括启动子、耐热鲨肌醇脱氢酶基因、终止子。
优选地，所述启动子、第一启动子和/或第二启动子包括但不限于T7启动子、lac启动子、tac启动子、trc启动子、PR启动子等。最优选地，所述启动子、第一启动子、第二启动子彼此独立地为T7启动子。
优选地，所述终止子、第一终止子和/或第二终止子包括但不限于T7终止子、rrnBT1终止子、rrnBT2终止子等。最优选地，所述终止子、第一终止子、第二终止子彼此独立地为T7终止子。
优选地，所述载体为pET系列、pGEX系列、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1等，最优选为pETDuet-1或pET-29a(+)。
优选地，制备所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等，最优选为大肠杆菌BL21(DE3)。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞膜通透性处理包括但不限于热处理、添加有机溶剂和/或添加表面活性剂。
优选地，所述热处理温度为45-95℃；进一步优选地，热处理温度为55-90℃；更优选地，热处理温度为60-80℃；最优选地，热处理温度为70℃。
优选地，所述热处理时间为1-40min；进一步优选地，热处理时间为5-30min；更优选地，热处理时间为10-25min；最优选地，热处理时间为20min。
优选地，所述热处理时的细胞浓度为OD600＝10-300；进一步优选地，细胞浓度为OD600＝20-200；更优选地，细胞浓度为OD600＝50-150；最优选地，细胞浓度为OD600＝100。
优选地，所述热处理可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；更优选地，所述热处理在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。其中，磷酸盐缓冲液例如磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液等。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述利用透性全细胞或透性全细胞的混合物催化肌肉肌醇制备鲨肌醇的反应体系中，底物肌肉肌醇的浓度为1-400g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝1-100；更优选地，底物肌肉肌醇的浓度为100-350g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝10-50；最优选地，底物肌肉肌醇的浓度为250g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝20-40。
优选地，所述透性全细胞的混合物中表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热鲨肌醇脱氢酶的透性全细胞的比例为0.1:1-10:1；更优选地为0.5:1-5:1；最优选地为1:1。


5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，利用细胞裂解液或细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备鲨肌醇的反应体系中，底物肌肉肌醇的浓度为1-400g/L，细胞裂解液或细胞裂解液的混合物为全细胞OD600＝10-100时的裂解液，加入量为反应液总体积的5％-95％；更优选地，底物肌肉肌醇的浓度为100-350g/L，细胞裂解液或细胞裂解液的混合物为全细胞OD600＝40-150时的裂解液，加入量为反应液总体积的50％-90％；最优选地，底物肌肉肌醇的浓度为250g/L，细胞裂解液或细...

【专利技术属性】
技术研发人员：游淳，李元，刘珊，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12