用于生产目标物质的方法技术

提供了用于生产目标物质，诸如香草醛和香草酸的方法。通过能够生产目标物质的微生物从碳源或目标物质的前体生产目标物质，所述微生物已经以参与SAM循环(SAM循环酶)的酶活性得以增加的方式进行了修饰。

Method for production of target substances

Methods for the production of target substances, such as vanillin and vanillic acid, are provided. By producing target substances from carbon sources or precursors of target substances by microorganisms capable of producing target substances, the microorganisms have been modified in a way that enzymes involved in the SAM cycle (SAM cycle enzyme) are increased.

【技术实现步骤摘要】
用于生产目标物质的方法专利
本专利技术涉及通过使用微生物生产目标物质例如香草醛和香草酸的方法。专利技术背景香草醛是提供香草气味的主要成分，并且在食品、饮料、香水等中用作芳香剂。香草醛通常通过从天然产品提取或通过化学合成来生产。也已经在香草醛的生产中尝试生物工程技术。例如，已经尝试通过使用各种微生物和原材料，例如丁子香酚、异丁子香酚、阿魏酸、葡萄糖、香草酸、椰子壳等来生产香草醛(KaurB.andChakrabortyD.,Biotechnologicalandmolecularapproachesforvanillinproduction:areview.ApplBiochemBiotechnol.2013Feb；169(4):1353-72)。另外，使用生物工程技术生产香草醛的其它方法包括以糖苷生产香草醛(WO2013/02288和WO2004/111254)，通过使用香草醛合酶从阿魏酸生产香草醛(JP2015-535181)，通过大肠杆菌的发酵生产香草酸且然后将香草酸酶促转化为香草醛(美国专利号6,372,461)。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)经由SAM循环再生，所述SAM循环是甲基化循环。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、甲硫氨酸合酶、甲硫氨酸腺苷转移酶和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶都参与SAM循环。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶催化S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)水解以生成L-高半胱氨酸和腺苷。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的实例包括SahH蛋白，其由sahH基因编码。甲硫氨酸合酶在存在甲基基团供体的情况下催化L-高半胱氨酸的甲基化以生成L-甲硫氨酸。甲硫氨酸合酶的实例包括MetE和MetH蛋白，其分别由metE和metH基因编码。甲硫氨酸腺苷转移酶在存在ATP的情况下催化L-甲硫氨酸转化成SAM。甲硫氨酸腺苷转移酶的实例包括MetK蛋白，其由metK基因编码。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶在存在电子供体的情况下催化5,10-亚甲基四氢叶酸的还原以生成5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的实例包括MetF蛋白，其由metF基因编码。专利技术概述本专利技术描述了用于改善目标物质诸如香草醛和香草酸的生产的新技术，从而提供有效生产目标物质的方法。本专利技术的目的是微生物能够以显著改善的方式生产目标物质诸如香草醛和香草酸，通过以使参与SAM循环的酶，诸如SAM循环酶的活性得以增加的方式修饰微生物进行。也就是说，本专利技术的一方面提供了用于生产目标物质的方法，所述方法包括：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以使S-腺苷甲硫氨酸循环酶的活性与非修饰菌株相比得以增加的方式进行了修饰，其中所述S-腺苷甲硫氨酸循环酶选自由甲硫氨酸腺苷转移酶、甲硫氨酸合酶、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶及其组合组成的组，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：(X)代谢物，所述代谢物的生物合成需要S-腺苷甲硫氨酸；(Y)L-甲硫氨酸；和(Z)其组合，条件是当仅甲硫氨酸腺苷转移酶的活性得以增加时，所述目标物质选自所述代谢物(X)。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述生产包括：在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述生产包括：通过使用所述微生物来将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述使用包括：在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述转化包括：允许所述微生物的细胞作用于反应混合物中的所述前体以在所述反应混合物中生产并积累所述目标物质。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述细胞是存在于所述微生物的培养肉汤中的细胞、从所述培养肉汤收集的细胞、存在于所述培养肉汤的处理产物中的细胞、存在于所述收集的细胞的处理产物中的细胞或这些的组合。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述前体选自由原儿茶酸、原儿茶醛、L-色氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酸及其组合组成的组。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，所述方法进一步包括收集所述目标物质。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述甲硫氨酸腺苷转移酶由metK基因进行了编码，所述甲硫氨酸合酶由metH基因和/或metE基因进行了编码，并且所述5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶由metF基因进行了编码。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中：所述metK基因编码选自以下组成的组的蛋白质：(1a)包含SEQIDNO:162的氨基酸序列的蛋白质，(1b)包含SEQIDNO:162的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸腺苷转移酶活性，和(1c)包含与SEQIDNO:162的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸腺苷转移酶活性；所述metH基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(2a)包含SEQIDNO:168或170的氨基酸序列的蛋白质，(2b)包含SEQIDNO:168或170的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性，和(2c)包含与SEQIDNO:168或170的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性；所述metE基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(3a)包含SEQIDNO:166的氨基酸序列的蛋白质，(3b)包含SEQIDNO:166的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性，和(3c)包含与SEQIDNO:166的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性；和所述metF基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(4a)包含SEQIDNO:172、174、或184的氨基酸序列的蛋白质，(4b)包含SEQIDNO:172、174、或184的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性，和(4c)包含与SEQIDNO:172、174、或184的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中通过增加编码所述S-腺苷甲硫氨酸循环酶的基因的表达来增加所述S-腺苷甲硫氨酸循环酶的活性。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数和/或修饰所述基因的表达控制序列来增加编码所述S-腺苷甲硫氨酸循环酶的基因的表达。本专利技术的另外的方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌、棒状杆菌细菌(coryneformbacterium本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于生产目标物质的方法，所述方法包括：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以使S‑腺苷甲硫氨酸循环酶的活性与非修饰菌株相比得以增加的方式进行了修饰，其中所述S‑腺苷甲硫氨酸循环酶选自由甲硫氨酸腺苷转移酶、甲硫氨酸合酶、5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶及其组合组成的组，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：(X)代谢物，所述代谢物的生物合成需要S‑腺苷甲硫氨酸；(Y)L‑甲硫氨酸；和(Z)其组合，条件是当仅甲硫氨酸腺苷转移酶的活性得以增加时，所述目标物质选自所述代谢物(X)。

【技术特征摘要】
2017.11.29 US 62/591,9101.用于生产目标物质的方法，所述方法包括：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以使S-腺苷甲硫氨酸循环酶的活性与非修饰菌株相比得以增加的方式进行了修饰，其中所述S-腺苷甲硫氨酸循环酶选自由甲硫氨酸腺苷转移酶、甲硫氨酸合酶、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶及其组合组成的组，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：(X)代谢物，所述代谢物的生物合成需要S-腺苷甲硫氨酸；(Y)L-甲硫氨酸；和(Z)其组合，条件是当仅甲硫氨酸腺苷转移酶的活性得以增加时，所述目标物质选自所述代谢物(X)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产包括：在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产包括：通过使用所述微生物来将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述使用包括：在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述转化包括：允许所述微生物的细胞作用于反应混合物中的所述前体以在所述反应混合物中生产并积累所述目标物质。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞是存在于所述微生物的培养肉汤中的细胞、从所述培养肉汤收集的细胞、存在于所述培养肉汤的处理产物中的细胞、存在于所述收集的细胞的处理产物中的细胞或其组合。7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述前体选自由原儿茶酸、原儿茶醛、L-色氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酸及其组合组成的组。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法进一步包括收集所述目标物质。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述甲硫氨酸腺苷转移酶由metK基因进行了编码，所述甲硫氨酸合酶由metH基因和/或metE基因进行了编码，并且所述5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶由metF基因进行了编码。10.根据权利要求9所述的方法，其中：所述metK基因编码选自以下组成的组的蛋白质：(1a)包含SEQIDNO:162的氨基酸序列的蛋白质，(1b)包含SEQIDNO:162的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸腺苷转移酶活性，和(1c)包含与SEQIDNO:162的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸腺苷转移酶活性；所述metH基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(2a)包含SEQIDNO:168或170的氨基酸序列的蛋白质，(2b)包含SEQIDNO:168或170的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性，和(2c)包含与SEQIDNO:168或170的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性；所述metE基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(3a)包含SEQIDNO:166的氨基酸序列的蛋白质，(3b)包含SEQIDNO:166的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性，和(3c)包含与SEQIDNO:166的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有甲硫氨酸合酶活性；和所述metF基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：(4a)包含SEQIDNO:172、174、或184的氨基酸序列的蛋白质，(4b)包含SEQIDNO:172、174、或184的包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性，和(4c)包含与SEQIDNO:172、174、或184的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性。11.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：B米杰茨，C罗奇，R穆拉里，朝里彩香，福井启太，户矢崎未来，野口景子，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP