用于测定ADAMTS13酶活性的方法和系统技术方案

公开了用于分析样品中具有血小板反应蛋白1型基序的酶解联蛋白和金属蛋白酶成员13(ADAMTS13)的活性的方法和系统。本文公开的方法和系统可用于诊断患者的血栓性血小板减少性紫癜。

A Method and System for the Determination of ADAMTS13 Enzyme Activity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定ADAMTS13酶活性的方法和系统对相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月11日提交的美国临时申请第62/406,693号的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
本专利技术涉及用于测定ADAMTS13(具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白和金属蛋白酶成员13)活性的方法和系统，ADAMTS13可用于诊断患者的血栓性血小板减少性紫癜。
技术介绍
血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是导致在小血管中形成血块的血液病症。这导致低的血小板计数(血小板减少症)，而血块可损害许多器官，包括肾脏、心脏和脑。如果不进行治疗，TTP的致死率约为90％。典型的治疗方法是血浆置换，在六个月时将致死率降低至约10％。大多数TTP病例是由ADAMTS13的活性降低引起的，ADAMTS13是特异性切割血液糖蛋白血管性血友病因子(vonWillebrandfactor,vWF)的蛋白酶。ADAMTS13在高剪切应力的循环条件下在酪氨酸-1605和甲硫氨酸-1606之间特异性切割vWF。ADAMTS13也称为血管性血友病因子切割蛋白酶。ADAMTS13活性的先天性缺乏和获得性缺乏(自身免疫)的特征是存在异常大的vWF因子多聚体，其比正常血浆中发现的较小多聚体更具有血小板粘附性，从而导致TTP。大多数TTP病例是特发性的，并且与针对ADAMTS13的抗体相关，针对ADAMTS13的抗体通过增加ADAMTS13从循环中的清除或直接抑制ADAMTS13蛋白水解活性来降低循环的功能酶水平，然而在患有先天性缺乏的患者中通常检测不到针对ADAMTS13的抗体。研究表明，用于针对ADAMTS13的IgG特异性自身抗体的定量免疫测定比用于检测针对ADAMTS13的抗体的功能性(即抑制)测定更敏感。从症状上来讲，TTP的特征是血栓性微血管病(TMA)，即在整个身体的小血管中形成血块，这可导致微血管病性溶血性贫血和血小板减少症。ADAMTS13活性的测量能够在区分TTP与许多具有不同潜在原因的临床相似疾病状况中发挥作用。这些可能与妊娠、器官移植和某些药物相关的综合征通常不会表现出ADAMTS13活性水平的显著降低。溶血性尿毒症综合征(HUS)在临床上与TTP相似，但与急性肾衰竭相关。与腹泻相关的HUS占大多数病例，通常由产生志贺毒素的大肠杆菌(Escherichiacoli)(O157:H7)感染引起。腹泻阴性或非典型HUS(aHUS)被认为是由儿童和成人中发生的不受控制的补体激活引起的，并且具有TTP的许多临床特征；然而，aHUS与ADAMTS13活性的严重降低(即<10％)无关。实际上，先天性ADAMTS13活性缺乏，也称为Upshaw-Schulman综合征，是与ADAMTS13活性水平低于正常ADAMTS13活性的10％相关的常染色体隐性病症。仅基于临床特征的疾病分类可能是不可靠的，并且可能导致不适当的治疗或延迟开始有效治疗。因此，在表现出血小板减少症和微血管病性溶血的实验室迹象的患者中，ADAMTS13活性的测量对于区分TTP与其他临床上相似的疾病状况是非常有价值的。一般而言，由于症状的敏锐性和严重性，当基于临床表现怀疑TTP时，在ADAMTS13活性测试之前启动救生全血浆置换(TPE)疗法。在许多情况下，如果获得正常的ADAMTS13活性测试结果，会停止TPE。因此，获得ADAMTS13测试结果越早，停止TPE治疗越早，这1)降低与(不必要的)TPE疗法相关的成本；2)允许临床医生关注症状的替代原因，并因此关注适当的疗法(Connell,N.T.等人，Transfusion2016,56(2),354–359)。因此，需要改进的实验室测试来测量处于或怀疑患有TTP风险的个体的样品中的ADAMTS13活性。需要更具成本效益从而允许更频繁的测试并且还可以更快地为临床医生提供测试结果的改进的实验室测试。专利技术概述本专利技术提供了用于测定可用于诊断患者的TTP的ADAMTS13活性的方法和系统。在某些实施方案中，本专利技术包括通过质谱法和/或液相色谱法-串联质谱法(LC-MS/MS)测量ADAMTS13的方法。例如，在一些实施方案中，本专利技术包括测定样品中ADAMTS13酶活性的方法，所述方法包括：(a)在允许ADAMTS13酶促切割外源肽底物的条件下，孵育样品与ADAMTS13的外源肽底物，以产生酶促切割产物；(b)电离酶促切割产物以产生切割产物的多电荷气相离子；以及(c)通过质谱法分析所述多电荷气相离子，以测定样品中酶促切割产物的存在或量，其中样品中酶促切割产物的产物的存在或量表示样品中ADAMTS13活性的存在或量。在某些实施方案中，本专利技术可包括测定样品中ADAMTS13活性的量的方法，所述方法包括：(a)在允许ADAMTS13酶促切割合成肽底物的条件下，孵育样品与ADAMTS13的合成肽底物和样品产物肽的同位素标记的等同物；(b)终止孵育的样品中的酶促切割；(c)使用液相色谱法或另一种纯化技术从样品的其他组分中部分纯化酶促切割产物和内标；以及(d)通过质谱法分析部分纯化的酶促切割产物和标准物，以测定样品中酶促切割产物和内标的量，其中酶促切割产物和内标的测定量之比表示样品中ADAMTS13活性的量。在其他实施方案中，本专利技术可包括用于测定样品中ADAMTS13活性的系统，所述系统包括：(a)用于在允许ADAMTS13酶促切割外源肽底物的条件下孵育样品与ADAMTS13的外源肽底物以产生酶促切割产物的工作站(station)；(b)用于电离酶促切割产物以产生所述切割产物的多电荷气相离子的工作站；和(c)用于通过质谱法分析多电荷气相离子以测定样品中酶促切割产物的存在和/或量的工作站，其中酶促切割产物的量表示样品中的ADAMTS13活性。在一些实施方案中，所述系统还可以包括用于部分纯化酶促切割产物的工作站。在一个实施方案中，所述系统可包括用于使用液相色谱法色谱分离酶促切割产物的工作站。本专利技术的方法和系统可以包括各种实施方案。例如，在某些实施方案中，所述方法可以在孵育步骤之后但在电离步骤之前包括部分纯化酶促切割产物的步骤，使得对部分纯化的酶促切割产物进行电离步骤。在某些实施方案中，所述系统可以包括用于进行这一步骤的工作站。在一个实施方案中，部分纯化酶促切割产物的步骤包括离心，并且对包含酶促切割产物的上清液进行电离步骤。另外和/或备选地，部分纯化酶促切割产物的步骤可包括液相色谱法，以产生包含酶促切割产物的洗脱液，并且对洗脱液进行电离步骤。另外和/或备选地，部分纯化酶促切割产物的步骤包括毛细管电泳，以产生包含酶促切割产物的洗脱液，并且对洗脱液进行电离步骤。另外和/或备选地，部分纯化酶促切割产物的步骤包括固相提取，以产生包含酶促切割产物的洗脱液，并且对洗脱液进行电离步骤。另外和/或备选地，部分纯化酶促切割产物的步骤包括过滤，以产生包含酶促切割产物的洗脱液，并且对洗脱液进行电离步骤。另外和/或备选地，部分纯化酶促切割产物的步骤包括过滤，以产生包含酶促切割产物的保留级分，并且对保留级分进行电离步骤。另外和/或备选地，部分纯化酶促切割产物的步骤包括使用酶促切割产物的亲和富集，并且对亲和富集的酶促切割产物进行电离步骤。在某些实施方案中，亲和富集技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于测定样品中具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白和金属蛋白酶成员13(ADAMTS13)的酶活性的方法，所述方法包括：(a)在允许ADAMTS13酶促切割外源肽底物的条件下，孵育所述样品与ADAMTS13的外源肽底物，以产生酶促切割产物；(b)电离所述酶促切割产物，以产生所述切割产物的多电荷气相离子；和(c)通过质谱法分析所述多电荷气相离子，以测定所述样品中酶促切割产物的存在或量，其中所述样品中所述酶促切割产物的产物的存在或量表示所述样品中ADAMTS13活性的存在或量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.11 US 62/406,6931.用于测定样品中具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白和金属蛋白酶成员13(ADAMTS13)的酶活性的方法，所述方法包括：(a)在允许ADAMTS13酶促切割外源肽底物的条件下，孵育所述样品与ADAMTS13的外源肽底物，以产生酶促切割产物；(b)电离所述酶促切割产物，以产生所述切割产物的多电荷气相离子；和(c)通过质谱法分析所述多电荷气相离子，以测定所述样品中酶促切割产物的存在或量，其中所述样品中所述酶促切割产物的产物的存在或量表示所述样品中ADAMTS13活性的存在或量。2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(a)之后，但在步骤(b)之前，所述方法还包括部分纯化所述酶促切割产物的步骤，并且其中对部分纯化的酶促切割产物进行步骤(b)。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述部分纯化所述酶促切割产物的步骤包括离心，并且其中对包含所述酶促切割产物的上清液进行步骤(b)。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述部分纯化所述酶促切割产物的步骤包括液相色谱法、毛细管电泳和固相提取或过滤中的一种或多种，以产生包含所述酶促切割产物的洗脱液，并且其中对所述洗脱液进行步骤(b)。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述部分纯化所述酶促切割产物的步骤包括过滤，以产生包含所述酶促切割产物的保留级分，并且其中对所述保留级分进行步骤(b)。6.根据权利要求2所述的方法，其中所述部分纯化所述酶促切割产物的步骤包括使用所述酶促切割产物的亲和富集，并且其中对亲和富集的酶促切割产物进行步骤(b)。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述亲和富集技术使用固定的金属亲和树脂、抗体、抗体片段、链霉抗生物素蛋白、蛋白质-G、蛋白质-A或适配体中的一种或多种。8.根据权利要求2所述的方法，在步骤(a)和(b)之间，并且在所述可选的部分纯化步骤之前，所述方法还包括终止孵育的样品中的酶促切割的步骤。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述终止步骤包括以下中的一种或多种：向所述孵育的样品中添加沉淀试剂；将所述孵育的样品的pH调节至低于pH5或高于pH9；将所述孵育的样品加热至高于50℃的温度；将所述孵育的样品冷却至低于15℃的温度；或向所述孵育的样品中添加ADAMTS13抑制剂。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源肽底物与SEQIDNO:3具有至少70％的序列相似性。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶促切割产物包含SEQIDNO:4。12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括使用电离技术电离所述酶促切割产物，所述电离技术包括电喷雾电离、大气压化学电离和大气压光电离中的至少一种。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤(c)使用串联质谱法。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤(c)使用具有包括下述中至少一种的质/荷比(m/z)的离子：602.8±2、182.1±2、281.1±2、462.7±2、512.3±2、600.3±2、605.3±2、811.4±2、924.5±2和1023.5±2。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤(c)包括测定所述ADAMTS13的比活性。16.根据权利要求1所述的方法，其中在下述时间点中的任何一个时间点向所述样品添加内标：(i)在步骤(a)之前；(ii)在步骤(a)过程中；或(iii)在步骤(a)之后，但在步骤(b)之前，并且其中在步骤(c)中测定所述内标的存在或量以及所述酶促切割产物的存在或量。17.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·P·格兰特，C·M·舒夫特，M·N·布拉德利，
申请(专利权)人：美国控股实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US