带有内部酶活性补偿的酶底物的竞争性测试制造技术

本发明专利技术涉及一种测定试样中的分析物的浓度的方法，以及用于实施所述方法的一种试纸和一种试剂盒，以及一种测试系统，其包括所述试纸和检测器。本发明专利技术还涉及将所述方法用于测定试样中的分析物的浓度的应用。

Competitive testing of enzyme substrates with internal enzyme activity compensation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】带有内部酶活性补偿的酶底物的竞争性测试本专利技术涉及一种测定试样中的分析物的浓度的方法，以及一种用于实施所述方法的试纸条，以及一种包括所述试纸条和检测器的测试系统。此外，本专利技术还涉及所述测定试样中的分析物的浓度的方法的应用。作为凝血级联中的最终因子，纤维蛋白原具有核心意义。纤维蛋白原经凝血酶裂解。这是凝血级联中的步骤，该步骤导致纤维蛋白单体，并且因纤维蛋白单体的聚集而导致机械上尚且不稳定的血凝块的形成。取决于(例如因手术或重伤造成的)失血、(例如因输液疗法造成的)血液稀释或者凝血因子的消耗(例如心脏外科或复杂的普外科手术期间的围手术期消耗)，可能发生一般的凝血因子缺乏或隔绝的纤维蛋白原缺乏。由此可能引发严重的出血。在许多具有严重创伤的患者中，血液中的纤维蛋白原浓度迅速下降，并且低纤维蛋白原浓度是与有所升高的死亡率相关。在血浆外无纤维蛋白原储备。因此，在迅速下降的情形下，仅能通过人体自身的机制对纤维蛋白原水平进行不充分的标准化。故必须通过外部供给对缺乏加以补偿。为了对纤维蛋白原缺乏进行补偿，先前常采用新鲜冰冻血浆(FreshFrozenPlasma，FFP)。然而，这样一来总是涉及传播感染或者引发肾脏或多器官衰竭的危险。此外，在输入FFP时需要输入较大体积(>15-20ml/kg体重)，从而对患者的已承受巨大负荷的心血管系统进一步造成负荷，这可能导致严重后果。因此，越来越多地，不再为患者输入FFP，而是仅补充实际需要的形式为凝血因子浓缩物的物质。为了能够针对性地使用纤维蛋白原，必须在手术期间在几分钟内实施对纤维蛋白原含量的精确测定。现有技术中已揭示过各种用于测定纤维蛋白原浓度的测试，其中包括Clauss测试、(例如借助进行的)血栓弹性检测和通过重量分析法测定。标准纤维蛋白原测试为Clauss测试。通过过量的凝血酶对纤维蛋白原进行快速裂解。形成纤维蛋白，其凝结成血凝块，从而实现试样的可加以检出的浑浊度。直至浑浊度阈值为止的时间与纤维蛋白原浓度关联，故可将此时间用于测定纤维蛋白原浓度。但血液基质并非无影响；浑浊度以及直至阈值为止的时间均受影响。故期望较高的特异性。该测试需要经良好培训的实验室人员和相应的装备。在常规运行中，处理时间预计为约55分钟。这样一来，结果通常过于滞后，或不再反映当前情形。根据出血动态特性，在采血40分钟后，已呈现截然不同的纤维蛋白原浓度。在全球范围内，可以在手术室中或者在重症监护病房中实施TEM公司的测试。该测试基于血栓弹性检测。在约10分钟内获得结果。但就约1g/L的介入阈值而言，该测试处于检出下限，因而不精确。此外，手术中的措施，如血浆增容剂的输入会对该测试产生严重影响。此外需要注意的是，用于实施血栓弹性检测的设备非常昂贵，故通常仅能在教学医院和其他非常大的医院中觅得。重量分析法的实施较为复杂，且需要的时间远高于Clauss测试。即便是在低浓度范围(<1.5g/L)内，目前也无法实现高精度的快速测试。然而，就有所降低的纤维蛋白原水平而言，这个浓度范围特别重要。因此，当前的针对创后出血患者的凝血管理的指导准则(Rossaint等人，CriticalCare(2016)20:100；第24和25页的建议28)建议：借助3至4g的纤维蛋白原浓缩物实施“盲式”初步治疗，并且随后以此后获得的纤维蛋白原浓度测定结果为基础，对进一步的纤维蛋白原疗法进行调整。其中，主要是在妇科(围产期出血)、心脏外科(心肺机上的手术期间的出血)、移植外科(特别是肝脏移植)以及“内科”(胃溃疡出血)领域内有类似建议。亦即，由于缺少替代性的用于测定纤维蛋白原浓度的测试方法，当前必须容忍以下情形：因“盲式”初始治疗而在纤维蛋白原输入中发生超剂量或剂量不足，这可能有致命的影响。因此，存在对用于特别是在低浓度范围(<1.5g/L)内以高精度测定纤维蛋白原浓度的快速测试的迫切需求。已知的纤维蛋白原测试所基于的测试原理的特征为，通过凝血酶过量快速地产生纤维蛋白单体，该纤维蛋白单体的聚合随即产生信号。测得的信号可以以下形式存在：试样的浑浊度(Clauss测试)，试样的粘度增大(血栓弹性检测)或者能够以重量分析方式测定的血凝块形成。然而，出于上述原因，已知的测试方法中的任何一个均不适合应用在实践中，因为Clauss测试和重量分析法的时间需求过高，且血栓弹性检测在<1.5g/L的相对纤维蛋白原浓度范围内的精度不足，且诸如XIII因子的其他参数或者注入的胶体状输液会对测量值造成负面影响。根据本专利技术，能够克服这些问题。本专利技术的基础是使用与已知方法截然不同的测试原理。在本说明书中以纤维蛋白原浓度的测定为例阐释这个原理，但这个原理可泛用于底物浓度的酶动力学测定。本专利技术的解决方案在于，通过酶动力学方法测定纤维蛋白原浓度。通过凝血酶对纤维蛋白酶和产生信号的、特别是发色底物或荧光底物进行裂解。也可以生成电化学信号。借助信号产生底物的因酶引发的反应，产生信号物质，特别是色素、荧光团或者还原剂，其中对该信号物质的形成进行检测。例如通过测量在特定波长条件下的吸收或荧光，或者通过在经适当选择的电位下的电流来进行检测。纤维蛋白原和信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争。分析溶液中的纤维蛋白原越多，裂解的荧光底物便越少，即吸收的提升越平缓。这个竞争已在文献中揭示(例如Mathur，Biochemistry1993，32，7568)。这种酶竞争测试直接取决于酶活性，以及酶活性与测试温度的温度相关性。此外，酶的活性通常在测试的存放过程中下降。视时间和存放条件而定，残留活性是可变的。pH值和测量波长也是严重影响测试结果的因素。因此，需要非常精确地将所有这些条件保持在恒定水平，以便获得可靠的结果。特别是对于酶活性而言，这近乎是不可能的，故取而代之地，在原本的测定前需要以已知的纤维蛋白原浓度实施校准。但纤维蛋白原也并非更加稳定。校准溶液特别是与血液基质有很大区别，其又对凝血酶活性产生影响。故校准特别易于出错。额外的步骤也使得操纵更加复杂和缓慢。鉴于这些困难，现有技术中揭示的测定纤维蛋白原浓度的方法不以这种酶动力学竞争测试为基础。但本专利技术的专利技术人发现，当检测因酶的活性产生的两个不同的信号且随后将其相互结算，从而将诸如温度、pH值和酶活性的难以控制的影响因素的关联消除时，即使不进行复杂的校准，也能够通过这种竞争测试实现可靠的浓度测定。这理论上精确地适用于活性酶的量。就温度和pH而言，可能因KM值的变化而存在小的残余干扰。但这些残余干扰预计极小，特别是当发出信号的底物与分析物具有相似的结构时。试样中的额外的酶或者抑制剂/活化剂也得到补偿，因为其相同地作用于两个测量。因此，本专利技术的原理的决定性优点在于对所有类型的干扰的简单补偿。原则上可通过不同的方案来实现本专利技术的原理。当信号产生底物的酶反应和分析物的酶反应均产生可测量的信号时，实现本专利技术的原理的方案为，例如在数个波长下并行检测这两个产生的信号，并对测得的值进行适当的结算。两个反应以相同的方式与酶活性和温度以及其他难以控制的影响因素相关，因为两个反应在同一分析溶液中进行。在此情形下，信号产生底物的反应用作内部标准。因此，如果以适当的方式相继得到测得的值，则能够一定程度上消除与这些影响因素的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定试样中的分析物的含量的方法，包括以下步骤：a.制备至少一个分析溶液，i.其中所述至少一个分析溶液包括酶、信号产生底物以及待分析试样的已知比例，以及ii.其中所述酶既能够使所述分析物、也能够使所述信号产生底物发生反应，故分析物与信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争，b.对通过酶催化反应在所述至少一个分析溶液中产生的两个信号S1和S2进行检测，c.根据所述信号计算反应因数，以及d.借助所述反应因数测定试样中的分析物的含量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.10 DE 10201612155381.一种测定试样中的分析物的含量的方法，包括以下步骤：a.制备至少一个分析溶液，i.其中所述至少一个分析溶液包括酶、信号产生底物以及待分析试样的已知比例，以及ii.其中所述酶既能够使所述分析物、也能够使所述信号产生底物发生反应，故分析物与信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争，b.对通过酶催化反应在所述至少一个分析溶液中产生的两个信号S1和S2进行检测，c.根据所述信号计算反应因数，以及d.借助所述反应因数测定试样中的分析物的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a中制备第一分析溶液A1和第二分析溶液A2。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度至少为所述第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度的两倍。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度至少为达到酶饱和所需浓度的80％。5.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中根据所述信号计算反应因数，具体方式为，根据信号测定所述信号产生底物的酶反应的起始速度v0(S1)和v0(S2)，并且将所述起始速度v0(S1)和v0(S2)相互结算。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述起始速度的结算包含求v0(S1)与v0(S2)的商。7.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述酶为凝血酶，以及，所述分析物为纤维蛋白原。8.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述信号a.在两个单独的分析溶液中通过所述信号产生底物的较高浓度的酶催化反应(信号S1)以及通过信号产生底物的较低浓度的酶催化反应(信号S2)产生，或者b.通过所述信号产生底...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·施米茨，C·韦伯，J·霍内斯，B·E·拉普，J·S·瓦克，
申请(专利权)人：达姆施塔特技术大学，
类型：发明
国别省市：德国,DE