利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法技术

本发明专利技术涉及使用显色测定法检测样品中内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应；其中LAL基本上不含凝固蛋白原。该方法还涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的组合物和试剂盒，以及制备它们的方法。

Detection of Endotoxin by Limulus Ameba-like Cell Lysate Basically Free of Coagulation Protein

The present invention relates to a method for detecting endotoxin in a sample by colorimetric assay, which includes: (a) contacting the sample with reagents containing Limulus ameba-like cell lysate (LAL) and chromogenic substrate; (b) measuring the chromogenic effect caused by the change of chromogenic substrate in the presence of endotoxin in the sample; in which LAL basically does not contain coagulation proteogen. The method also involves combinations and kits containing LAL that contains essentially no coagulation proteins, and methods for preparing them.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法专利
本专利技术涉及使用显色测定法检测样品中内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。该方法还涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的组合物和试剂盒，以及制备它们的方法。
技术介绍
革兰氏阴性菌内毒素是一种生物热原，当其被引入静脉内时引起发热。内毒素，也称为脂多糖(LPS)，存在于革兰氏阴性菌的外膜中，例如沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，志贺氏菌(Shigella)和奈瑟氏菌(Neisseira)。内毒素引发的毒性机制是由脂多糖的脂质部分引起的。例如，当生物体内的细菌发生溶解时，进入血流的脂质的反应可以一直到补体系统的激活。该脂质部分导致不同细胞因子的释放，例如白细胞介素1和8。肿瘤坏死因子的产生也可以被激活。产生的感染与炎症过程有关，并且可能对感染的生物体构成很大的危险。白细胞介素1是生物体作为免疫反应和对抗炎症而释放的一系列细胞因子。该信号导致嗜中性粒细胞向感染发生的地方迁移，产生趋化性。这有利于吞噬作用的发生；然而，在某些情况下，根据个体免疫系统的状态和感染程度，内毒素可能导致全身性脓毒血症，以及脓毒血症带来的风险。众所周知，在许多情况下，革兰氏阴性菌在高等哺乳动物中引起多器官衰竭甚至全身感染导致死亡。由于与内毒素相关的不利影响，制药行业和医疗保健界对内毒素的早期和敏感检测至关重要。鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试验在20世纪70年代作为检测内毒素的方法在商业上引入。LAL衍生自蝎鲎(horseshoecrab)，美洲鲎(Limuluspolyphemus)的血细胞或阿米巴样细胞。最初的LAL测试构成了丝氨酸蛋白酶的级联，其由痕量水平的内毒素触发，在反应结束时达到凝胶凝块。因子C通常作为酶原存在，是该凝血级联的引物。在体内，因子C是完美的生物传感器，它提醒蝎鲎存在革兰氏阴性入侵者。止血终点诱捕入侵者，杀死它并限制进一步的感染。可以改良LAL测试以使用不同的方法来测量阿米巴样细胞对内毒素的反应。这些方法包括所谓的凝胶-凝块法，比浊法和显色法。在国际药典中推荐这些LAL测试作为检测用于生产药物和最终产品的原料中的细菌毒素的方法。这些测试对于化妆品工业和食品生产也是有用的，因为它是FDA(食品和药品管理局)推荐的用于检测热原的方法。专利技术概述本文提供了使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，所述显色测定法包含基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)。本文的实施方式涉及使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。在一些实施方式中，显色底物是共价键合至多于三个氨基酸的对＝硝基苯胺。在一些实施方式中，显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，由于酶促反应导致显色底物的变化。在一些实施方式中，酶促反应是从多肽切割发色团。在一些实施方式中，通过检测380nm-420nm处的吸光度来测量显色效应。在一些实施方式中，通过检测405nm处的吸光度来测量显色效应。在一些实施方式中，试剂是液体。在一些实施方式中，试剂是水性液体。在一些实施方式中，将试剂冻干，然后在与样品接触之前在水性液体中重建。在一些实施方式中，将LAL冻干，然后在与样品接触之前重建。在一些实施方式中，将显色底物冻干，然后在与样品接触之前重建。在一些实施方式中，所述样品是生物样品。在一些实施方式中，样品选自：胃肠外剂型，疫苗，抗生素，治疗性蛋白质，治疗性核酸，治疗性抗体和生物学产品。在一些实施方式中，通过SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于5重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于2重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于0.5重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，使用单个比色皿光谱法，多个比色皿光谱法或酶标仪进行显色测定。在一些实施方式中，该方法还包括将显色效应与标准品进行比较以确定样品中内毒素的量。在一些实施方式中，本公开内容涉及使用显色测定法检测生物样品中的内毒素的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA的水性试剂接触；(b)测量样品中内毒素存在下从Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA酶促切割pNA所引起的405nm处吸光度的变化；其中LAL基本上不含凝固蛋白原。在一些实施方式中，本公开的方法具有增加的灵敏度。在一些实施方式中，该方法具有>0.001EU/mL内毒素的灵敏度。在一些实施方式中，本公开内容的方法涉及包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的组合物，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。在一些实施方式中，显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，将LAL和显色底物冻干。在一些实施方式中，LAL和显色底物在水溶液中。在一些实施方式中，本公开内容的方法涉及试剂盒，其包含：(a)鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)，其中LAL基本上不含凝固蛋白原；(b)显色底物；(c)使用LAL和显色底物检测内毒素的说明书。在一些实施方式中，LAL是冻干的。在一些实施方式中，LAL在水溶液中。在一些实施方式中，LAL和显色底物在单个容器中。在一些实施方式中，试剂盒还包括含有LAL的无菌容器。在一些实施方式中，无菌容器是无菌小瓶。在一些实施方式中，试剂盒还包含对照标准品内毒素。在一些实施方式中，本公开内容涉及制备基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)的方法，该方法包括：(a)提供包含LAL的组合物，其中LAL包含凝固蛋白原；(b)调整缓冲液；(c)使用20kDa至50kDa的过滤器对(b)的组合物进行切向流过滤，从而分离出基本上不含凝固蛋白原的LAL。在一些实施方式中，TFF以350ml/分钟至500ml/分钟的流速进行。在一些实施方式中，缓冲液是Tris缓冲液或MES缓冲液。在一些实施方式中，缓冲液的pH为约7.0至8.0。在一些实施方式中，过滤器是切向流过滤(TFF)。在一些实施方式中，TFF过滤器是改性聚醚砜(mPES)膜过滤器。附图说明本技术的前述和其它特征和方面可基于如下实施方式的描述并如附图所示更好理解。附图纳入本文且形成说明书的一部分，其进一步用于说明本技术的原理。图1：内毒素相关级联的示意图，包括浊度和显色分析点。图2：包含常规LAL与基本上不含凝固蛋白原的LAL的样品的比较显示在多个起始(onset)毫光密度(mOD)值下的分离增加。EU/ml＝每毫升内毒素单位。图3：比较标准LAL(L)和两性洗涤剂(Z)的浓度对反应速度的影响。增加L和Z的浓度可提高每种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，所述方法包括：a.使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；b.测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应；其中，所述LAL基本上不含凝固蛋白原。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.03 US 62/370,4931.一种使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，所述方法包括：a.使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；b.测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应；其中，所述LAL基本上不含凝固蛋白原。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述底物是共价键合至多于三个氨基酸的对硝基苯胺。3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述显色底物的变化由于酶促反应而发生。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述酶促反应是从多肽切割发色团。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，通过测量380nm-420nm处的吸光度来完成测量显色效应。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，通过测量405nm处的吸光度来完成测量显色效应。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述试剂是液体。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述试剂是水性液体。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，将所述试剂冻干，然后在与所述样品接触之前在水性液体中重建。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，将LAL冻干，然后在与所述样品接触之前重建。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，将显色底物冻干，然后在与所述样品接触之前重建。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述样品是生物样品。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述样品选自：胃肠外剂型，疫苗，抗生素，治疗性蛋白质，治疗性核酸，治疗性抗体和生物学产品。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，通过SDS-PAGE和蛋白质染色测量，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于5重量％的凝固蛋白原。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，通过SDS-PAGE和蛋白质染色测量，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于2重量％的凝固蛋白原。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，通过SDS-PAGE和蛋白质染色测量，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于0.5重量％的凝固蛋白原。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，使用单个比色皿光谱法，多个比色皿光谱法或酶标仪进行显色测定。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：将所述显色效应与标准品进行比较以确定所述样品中的内毒素...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·斯特姆博，D·S·赫伯斯特，K·E·尼科尔斯，
申请(专利权)人：隆萨沃克斯维尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US