一种棘阿米巴荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒内设有DNA提取液、特异性引物、TaqMan探针、PCR缓冲液、dNTP、尿嘧啶DNA糖基化酶、DNA聚合酶和DNA定量标准品组成。通过建立棘阿米巴基因拷贝数定量分析模型，根据样品各自的Ct值，可得出所测样本中棘阿米巴含量；本发明专利技术试剂盒既可以用于棘阿米巴的定性检测也可以进行定量检测，操作简单、效果显著；本发明专利技术试剂盒具有特异性好、灵敏度高的特点，降低了常规PCR方法的假阳性率，减少了常规PCR方法的产物污染问题，从而实现对棘阿米巴进行快速、准确、特异性的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，具体说是一种棘阿米巴荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
棘阿米巴是一种自生生活原虫，广泛存在于水和土壤中，它已在池塘、淡水、海水、 土壤、灰尘、腐败植物、空气、空调、医疗设备(如胃清洗管和牙灌洗器)、接触镜、接触镜溶液，及人畜粪便中甚至人和动物组织中分离出。根据大小和形态不同，将棘阿米巴分为I、 II和III三组，目前，已确定的种属有27种。通过己糖激酶、酯酶、酸化磷酸酶可快速区分种属，其中至少有8种和人类棘阿米巴角膜炎相关，包括哈氏阿米巴属(Hartmarmella)、 卡氏棘阿米巴(A · castellanii)、柯氏棘阿米巴(A · culbertsoni)、多噬棘阿米巴 (A - polyphaga)等，其中以卡氏棘阿米巴和多噬棘阿米巴引起的棘阿米巴角膜炎最常见。 目前棘阿米巴有15种基因型(Tl T15)，已知有致病性的包括T3J4、T5、T6、T11、T15型， 其中绝大多数棘阿米巴角膜炎患者的基因型为T4。国内研究证实，棘阿米巴性角膜炎的棘阿米巴基因型多为T4型，少数为T3型，某些特殊的18S rDNA基因型的棘阿米巴有较强的嗜角膜性，但其确切的分子机制及由此导致的生物学特性和致病性的不同，尚有待深入研究。人类棘阿米巴感染是条件性的，可累及免疫抑制病人的皮肤和中枢神经系统，引起皮肤棘阿米巴病和肉芽肿性脑膜炎，还可侵犯角膜引起角膜炎。目前，诊断棘阿米巴的主要手段有以下3种1.显微镜检查角膜刮片是一种有效方法，通常采用10%的KOH湿涂片直接镜检可见棘阿米巴，苏木精-伊红染色和吉姆萨染色亦能查见滋养体和包囊，星形包囊更易查见，而含有空泡和核仁居中的滋养体与炎症细胞相似。其检测较困难，阳性率较低，容易漏检。激光共聚焦显微镜作为一种非创伤性的诊断手段以及其高特异性和敏感性在一些地区成为棘阿米巴感染眼睛的优先诊断技术。2.培养法稀释的胨酵母膏葡萄糖培养基(如0. 05,0. 05,0. 1% w / ν)用铺有一层大肠杆菌或产气肠杆菌的1. 5%非营养琼脂进行固化，棘阿米巴生长丰富。根据阿米巴数目的不同，可在 30°C培养数天到数周。本法耗时长，难以适应临床需要。3.分子生物学检查用PCR技术诊断棘阿米巴感染显示了高敏感性与特异性。多以18S rDNA为模板，利用特异性引物JDP1-JDP2配合来检测棘阿米巴原虫，证实18S rDNA 的PCR扩增技术对诊断早期棘阿米巴感染有重要的临床应用价值。但是，该方法的灵敏度和特异性尚有待于进一步提高，特别是扩增后的电泳检测容易引起PCR产物污染，造成假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是根据棘阿米巴18S基因保守区设计的引物和TaqMan探针，提供的一种检测棘阿米巴的实时荧光定量检测试剂盒，实现对棘阿米巴寄生虫感染的快速、特异性检测。一、一种检测棘阿米巴的实时荧光定量检测试剂盒一种检测棘阿米巴的实时荧光定量检测试剂盒，试剂盒内设有DNA提取液、特异性引物、TaqMan探针、PCR缓冲液、dNTP、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶和DNA定量标准品。所述的DNA提取液由分装的异丙醇、体积浓度为75%的乙醇、和TE缓冲液和样品处理液(体积比为25: M :1的TE饱和酚、氯仿和异戊醇混合溶液)组成；所述的特异性引物序列如下 上游引物5' -GCC CAG ATC GTT TAC CGT GAA-3， 下游引物5' -TAA ATA TTA ATG CCC CCA ACT ATC CC-3，所述的 iTaciMan 探针序列为5’-FAM-CT GCC ACC GAA TAC ATT AGC ATG GG-BHQ1-3’ 其中FAM为荧光报告基团，HBQl为荧光淬灭基团。所述的PCR缓冲液，包含的成份如下10-100mmol/L的Tris-HCl CpH 8.0)、质量浓度为0. 1%-0. 5%的聚乙二醇辛基苯基醚、质量浓度为0. 1%的乙基苯基聚乙二醇和 1. 0-10. Ommol/L 的氯化镁。 所述的dNTP为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的等摩尔数混合物；所述的DNA定量标准品，是人工构建的重组质粒DNA，由目的基因(其碱基序列如序列表序列4)和pUCml质粒载体连接所构建的，其浓度为IO6拷贝/微升； 所述的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA聚合酶，均为市售商品。二、一种棘阿米巴荧光定量PCR检测试剂盒的制备及检测方法一种棘阿米巴荧光定量PCR检测试剂盒的制备及检测方法，具体操作步骤为 1、引物设计和合成参考GenBank上登录的棘阿米巴全基因序列，利用生物信息学分析软件，对棘阿米巴的18S基因进行序列比对，在其序列保守区段设计引物和TaqMan探针，并进行人工合成，其序列如下上游引物5' -GCC CAG ATC GTT TAC CGT GAA-3，； 下游引物5' -TAA ATA TTA ATG CCC CCA ACT ATC CC-3'； TaqMan 探针5，-FAM-CT GCC ACC GAA TAC ATT AGC ATG GG-BHQ1-3， 其中FAM为荧光报告基团，HBQl为荧光淬灭基团。2、DNA定量标准品的制备以棘阿米巴为标本，将其灭活后提取棘阿米巴DNA为模板，采用上述步骤1人工合成的上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得目的基因(其碱基序列如SEQ ID N0:4)，将目的基因与pUCml载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应，构重组质粒；将制备的重组质粒转化入大肠杆菌TGl感受态细胞内，进行蓝白斑筛选，提取质粒DNA，然后以实时荧光定量PCR 方法鉴定阳性重组子。将阳性菌落大量扩增培养后，提取重组质粒DNA后，用紫外分光光度计将重组质粒进行定量，计算重组质粒DNA的原始拷贝数，然后用无菌超纯水按比例稀释成浓度为IO6拷贝数/μ 1。3、待测样本DNA提取取待测样本50μ 1，依次加入样品处理液((体积比为25: 24 1的TE饱和酚、氯仿和异戊醇混合溶液))200 μ 1，剧烈振荡15秒混合均勻，4°C、13500r / min离心5 min，将上清转移至新管，加入等体积的_20°C放置的异丙醇，振荡混合均勻，4°C、13500 r / min离心15 min，弃上清，用500 μ 1体积浓度为的75%乙醇洗涤沉淀，4°C、13500 r / min离心5 min, 弃上清，94°C快速烘干后加入25μ1的TE缓冲液，充分溶解后，置于-20°C冻存备用。4、样本检测及结果判断结果分析将10倍的PCR缓冲液5 μ 1，10mmol/L dNTP 1 μ 1，上游引物、下游引物、TaqMan探针各5-20pmol，1.0 U尿嘧啶DNA糖基化酶，2. 5 U DNA聚合酶，待测样本DNAlOyl,加入同一个取PCR管，加水补至50 μ 1，得到PCR反应体系。将所制备的PCR反应体系置于实时荧光定量PCR仪，反应条件为37°C IOmin, 94°C 5min后，进入循环94°C 20秒，60°C Imin ；循环40次，在每个循环60°C检测荧光信号。反应结束，由实时荧光PCR仪自动生成所测样本的实时扩增曲线，可得出其Ct值；5、定量分析标准曲线的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李智涛，戚纪胜，王新彩，任丽芳，冯艳铭，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：
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