一类人羧酸酯酶1的特异性探针底物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一类人羧酸酯酶1的特异性探针底物及其应用。该类特异性探针底物为4-羟基或4-烷氧基萘酰亚胺N-丁酰甲酯，其可用于检测不同生物样本中hCE1的存在与否及其酶活的定量测定。hCE1酶活测定的具体流程如下：选择萘酰亚胺N-丁酰甲酯水解反应为探针反应，选择适宜的底物浓度在线性反应区间内通过定量检测单位时间内其水解代谢产物N-丁酸萘酰亚胺的生成量来检测各种生物样本(离体组织、细胞、血浆、在体及整体器官)中hCE1酶的实际活性。本发明专利技术不仅可用于不同来源生物样本中hCE1酶活的定量评估，此外借助该探针反应还可用于体外快速筛选hCE1的抑制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属医药生物
，具体涉及一类人羧酸酯酶1(hCE1)的特异性探针底物及其应用。
技术介绍
作为脏器和组织的特征标志物，hCE1在人群的肝脏中含量很高，其蛋白表达量在肝脏分布蛋白中排前十位。hCE1是一种膜结合蛋白，定位于细胞内质网中【CANCERRESEARCH1998；58:3627-32&DrugMetab.Pharmacokinet.2006；21:173-85】，同时也会分泌到细胞外进入血液循环系统【Proteomics2009；9:3989–99】。hCE1的基本代谢反应是催化含较小醇基和较大酰胺基底物的水解。虽然，在多种组织的中都检测到hCE1的蛋白表达，但其在人肝脏组织含量远高于其它组织。hCE1参与多种外源性物质的代谢清除，例如药物奥司他韦、哌醋甲酯等。同时，hCE1在维持人体正常生理功能功能发挥不可忽视的作用，参与人体内胆固醇酯和游离脂肪酸的运输和代谢过程，维持脂质代谢平衡【Chemistry&Biology,Vol.10,341–349,April,2003】。在正常健康人体中，hCE1除了以较高的含量分布在肝组织的细胞中，也有少量hCE1在血浆中被检测到，更重要的是，肝细胞肝癌患者血浆中的hCE1是健康人群的2-5倍，因此hCE1被认为是肝细胞肝癌早期诊断的一种良好的潜在血清学标志物【Proteomics2009,9,3989–3999】。此外，肝细胞破损相关的肝脏疾病患者也会有hCE1释放入血，引起血浆中hCE1浓度发生变化，因此，血浆中hCE1可作为肝脏急性损伤的标志物。hCE1的分布存在很大的个体差异，hCE1酶的表达和功能本身会受到人体遗传、年龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，hCE1酶的活性检测方法具有广阔的临床应用前景，可用于评价人体肝脏功能异常、药物及毒物导致的肝毒性、肝细胞癌早期诊断、肝功能个体化评估、以及部分前体药物的个性化使用等。此外，hCE1作为维持人体脂质代谢平衡的重要蛋白，其抑制剂可作为降血脂药物使用，hCE1也被FDA批准为重要的药物作用靶点。hCE1活性的快速表征方法也可用于新药研发早期发现及评估hCE1新型高效抑制剂。因此，开发高效、超灵敏、高特异性的hCE1活性检测方法对于临床样本中hCE1活性的检测，以及新药高内涵高通量筛选至关重要。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种人羧酸酯酶1(hCE1)的特异性探针底物及其应用，其经hCE1水解后可生成具有荧光属性的水解产物N-丁酸萘酰亚胺。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制剂活性评价快速省时的特点。本专利技术的目的在于提供一类人羧酸酯酶1(hCE1)的特异性探针底物及其应用，该类特异性探针的水解产物具有良好的荧光属性，易于检测。利用该探针反应可对多种生物体系中的hCE1的分布和功能进行定量评价。本专利技术一类人羧酸酯酶1(hCE1)的特异性荧光探针底物，该类底物的甲酯键可被hCE1特异性水解为相应的水解产物；该底物为4-羟基或4-烷氧基萘酰亚胺N-丁酰甲酯，其结构通式下：其中R为-H、-CH3取代基中的一种。本专利技术还提供了一种hCE1的特异性荧光探针的应用，该类底物可被hCE1特异性识别并催化发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物N-丁酸萘酰亚胺的生成量即可测定不同酶源(单酶、组织、细胞、血浆)中的hCE1活性；所述生物样本可为重组表达的hCE1、人或动物的细胞制备物、组织制备液或血浆及其他常见生物样本。具体测定方法为：具体测定方法为：1)体系中以式(1)所示任意化合物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；；2)在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度介于20-60℃之间，；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，；3)反应时间为5-120min，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；4)测定单位时间内水解产物生成量作为hCE1活性的评价标准。所述具体测定方法中单点测定时底物浓度优选Km，优选37℃为最优反应时间，优选pH7.4为最优反应pH。所述底物消除率或水解产物的生成率介于0.1％～20％之间。所述探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长372nm，在420～520nm进行荧光发射谱的检测。本专利技术提供的一类hCE1的特异性荧光探针的应用，该特异性探针底物及其水解反应还可用于hCE1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。本专利技术提供的一类hCE1的特异性荧光探针的应用，该特异性探针底物及相应hCE1活性检测过程不会受到生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中hCE1酶活的定量检测。本专利技术提供了所述特异性荧光探针的应用，该特异性探针底物用于重组表达的hCE1、人或动物的细胞制备物、组织制备液、血浆等常见生物样本中酶活的定量测定，以及利用该探针反应快速筛选hCE1酶的抑制剂。本专利技术涉及的hCE1特异性探针反应具有如下优点：1.高特异性：萘酰亚胺N-丁酰甲酯类化合物可被hCE1特异性代谢成一个代谢产物，即甲酯键断裂的水解产物，人体其余水解酶均不参与该反应。2.高灵敏度：萘酰亚胺N-丁酰甲酯类化合物可被hCE1快速水解释放出N-丁酸萘酰亚胺，且底物与产物均具有良好的荧光发射光谱特征，可利用荧光检测器实现超灵敏检测，其对目标物的检测下限可达pM级。附图说明图1.N-丁酰甲酯-4-羟基-1,8萘酰亚胺的13C-NMR谱图；图2.N-丁酰甲酯-4-羟基-1,8萘酰亚胺及水解产物的检测色谱图；图3.N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亚胺的人重组单酶筛选试验结果；图4.12例HLM对N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亚胺的水解速率差异；图5.人血浆水解N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亚胺的化学抑制谱图；图6.N-丁酰甲酯4-乙氧基-1,8萘酰亚胺测定不同细胞中hCE1的活性谱；图7.N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亚胺的合成路线。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亚胺的合成将4.2mmol4-氨基丁酸加入到含有1克(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反应过夜后，加入200ml水，析出大量固体，过滤，真空干燥得到米黄色固体N-丁酸-4-溴-1,8-萘酰亚胺，产率80-90％。将800mg化合物N-丁酸-4-溴-1，8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反应过夜后，冷却，用1M的盐酸将pH调至酸性，析出大量黄色固体，过滤，大量水洗，真空干燥得到黄色固体N-丁酸-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺，产率80-90％。将0.1gN-丁酸-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺溶解于15mL甲醇,加入浓硫酸若干滴。反应体系搅拌回流8小时。冷却到室温后，真空干燥后通过硅胶柱纯化，洗脱液二氯甲烷/甲醇(10:1)，真空得到干燥得到0.086g黄色固体，产率82.1％。化合物经高分辨质谱、核磁鉴定为N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺(图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类人羧酸酯酶1的特异性探针底物，其特征在于：该类底物的甲酯键可被hCE1特异性水解为相应的水解产物；该底物为4‑羟基或4‑烷氧基萘酰亚胺N‑丁酰甲酯，其结构通式如下：其中R为‑H、‑CH3或乙基等烷基取代基中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一类人羧酸酯酶1的特异性探针底物，其特征在于：该类底物的甲酯键可被hCE1特异性水解为相应的水解产物；该底物为4-羟基或4-烷氧基萘酰亚胺N-丁酰甲酯，其结构通式如下：其中R为-H、-CH3或乙基等烷基取代基中的任意一种。2.按照权利要求1所述一类的人羧酸酯酶1特异性荧光探针的应用，其特征在于：该类底物作为hCE1的特异性探针，可通过定量检测单位时间内水解产物N-丁酸萘酰亚胺的生成量来测定不同生物样本中的hCE1活性。3.按照权利要求2所述一类的人羧酸酯酶1特异性荧光探针的应用，其特征在于：所述生物样本可为重组表达的hCE1、人或动物的细胞制备物、组织制备液或血浆及其他常见生物样本。4.按照权利要求2所述一种人羧酸酯酶1特异性荧光探针的应用，其特征在于：该类底物作为hCE1的特异性探针，可通过定量检测单位时间内水解产物N-丁酸萘酰亚胺的生成量来测定不同生物样本中的hCE1活性；具体测定方法为：1)体系中以式(1)所示任意化合物作为特异性探针底物；底物浓度选择
\t1/10～10Km；；2)在PBS或Tris-HCl等常用缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，崔京南，葛广波，王丹丹，吕侠，冯磊，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21