一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用微生物连续生产1,3‑丙二醇的方法，首先在微氧条件下，以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；然后在发酵培养基中接入发酵种子液，进行厌氧发酵，至发酵液中1,3‑丙二醇浓度大于60g/L，转换至微氧发酵，控制发酵体系pH至偏酸性，静置分层后，抽取上层清液，同时加入补充培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后从厌氧发酵开始重复进行，以实现连续发酵。本发明专利技术采用的连续发酵模式，能够缩短发酵时间，大幅提高生产效率。

A Method for Continuous Production of 1,3-Propanediol by Microorganisms

The present invention relates to a method for continuous production of 1,3_propanediol by microorganisms. Firstly, under microaerobic conditions, the fermentation strain is cultured in seed medium to obtain fermentation seed liquid; then, the fermentation seed liquid is added into the fermentation medium to carry out anaerobic fermentation, and the concentration of 1,3_propanediol in fermentation liquid is more than 60 g/L, which is converted to microaerobic fermentation, and the pH of fermentation system is controlled to partial acid. After static stratification, the supernatant was extracted, supplementary medium was added, and the pH of fermentation system was controlled to be alkaline, then repeated from anaerobic fermentation to achieve continuous fermentation. The continuous fermentation mode adopted by the invention can shorten the fermentation time and greatly improve the production efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种利用微生物连续化生产1,3-丙二醇的方法。
技术介绍
1,3-丙二醇（1,3-Propanediol，PDO）主要用于生产性能优异的新型聚酯PTT（PolytrimethyleneTerephthalate）。由它合成的聚酯具有独特的性质和优异的性能，而且可以使聚酯塑料具有易于自然循环的可生物降解特性。近年来，作为重要的有机合成原料和中间体，因其独特性能以及广泛的用途成为研究开发的热点。1,3-丙二醇工业生产方法主要有化学法和生物法两大类。生物法是目前研究的热点，根据原料不同可分为葡萄糖一步转化法和甘油转化法。生物法虽然起步较早，但是直到二十世纪八十年代才逐渐引起人们的重视。与化学法相比，微生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资少和环境良好等特点，是一种生产成本最低、污染最少的方法，符合当今“绿色化工”和“可持续性发展”的要求。生物法生产1,3-丙二醇，目前存在产物浓度低、生产周期长和转化率低等问题，直接影响生物法生产1,3-丙二醇的规模化应用。解决上述问题，既可以通过生物化工上游技术，利用基因工程等技术手段，对发酵菌种加以改造，以提高菌种的发酵水平、产物的转化能力，也可以在生物发酵阶段，连续、分批补料、反应分离相耦合的培养方式，优化发酵条件，提高发酵水平。目前生物法生产1,3-丙二醇主要采用批次发酵模式。中国专利CN1348007A公开了一种微生物微氧发酵生产1,3-丙二醇的方法，其所使用的微生物细胞不仅在厌氧条件下，而且在微氧条件下都能将甘油转化为1,3-丙二醇。中国专利CN1434122A公开了一种采用两段双底物集成发酵生产1,3-丙二醇的方法，其二级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物，将好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵罐中进行。中国专利CN1955304A公开了一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于通过在发酵培养基中或在菌体生长的指数期添加适量的有机中间代谢成分，实现了1,3-丙二醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布，进而实现高效的1,3-丙二醇发酵。上述方法虽然能够起到简化流程、缩短培养周期等优点，但是由于发酵体系中1,3-丙二醇产物浓度较低，针对批次发酵模式所形成的技术方案，并不能显著提高生产效率。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法。本专利技术采用的连续发酵模式，能够缩短发酵时间，大幅提高生产效率。本专利技术利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法，包括如下内容：（1）菌种培养：以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；（2）连续发酵：a、在发酵培养基中接入发酵种子液；b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油；c、至发酵液中1,3-丙二醇浓度大于60g/L，转换至微氧发酵，发酵过程中控制发酵体系pH至偏酸性，静置分层后，抽取上层清液，同时加入新鲜培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后重复步骤b、c，以实现连续发酵。本专利技术中，步骤（1）所述的发酵菌为能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的微生物，主要为兼性厌氧菌，具体如克雷伯杆菌（Klebsiellapneumoniae）、弗氏柠檬杆菌（Citrobacterfreundii）等，优选克雷伯杆菌。本专利技术中，步骤（1）将活化的发酵菌液接种至种子培养基中，接种体积比为1%～30%，优选5%～15%；培养温度为20～40℃，优选35～40℃；搅拌转速为100～500rpm，优选200～400rpm。进一步地，优选在微氧条件下培养，所述的微氧条件是在培养过程无气体如氮气等通入的发酵模式。所述的种子培养基为本领域常规使用的培养基，优选种子培养基的配方为：NH4Cl4.26g/L、KCl0.2g/L、NaH2PO4·H2O1.1g/L、Na2SO40.23g/L、MgCl2·6H2O0.2g/L、柠檬酸0.34g/L、酵母膏2.0g/L、Vc0.1g/L、甘油30g/L。本专利技术中，步骤（2）发酵种子液的接种体积比为1%～30%，优选5%～15%。所述的发酵培养基中添加阳离子型生物多糖基聚合物，如氨基多糖聚合物、淀粉基聚合物等，优选分子量为5万～30万的壳聚糖，更优选中密度壳聚糖。阳离子型生物多糖基聚合物的添加质量浓度为0.1%～1.0%，优选0.1%～0.5%。所述的发酵培养基为本领域常规使用的培养基，优选的发酵培养基配方为：NH4Cl5.35g/L、KCl0.2g/L、NaH2PO4·H2O1.38g/L、Na2SO40.28g/L、MgCl2·6H2O0.26g/L、柠檬酸0.42g/L、酵母膏1.0g/L、Vc0.1g/L、甘油40g/L。本专利技术中，步骤（2）发酵过程中采用通入氮气的厌氧发酵模式，氮气通气量为0.1～1.0vvm，优选0.1～0.3vvm；发酵温度为20～40℃，优选为35～40℃；搅拌转速为100～500rpm，优选200～400rpm。本专利技术中，步骤（2）发酵过程中流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在20g/L～40g/L。本专利技术步骤（2）中，当1,3-丙二醇浓度大于60g/L时，优选60～65g/L时，转换至微氧发酵，即在培养过程无气体通入的发酵模式，微氧发酵条件为：温度为20～40℃，优选35～40℃；搅拌转速为200～600rpm，优选200～400rpm。微氧发酵过程中进行pH控制，使发酵体系pH为5.5～6.5，优选5.8～6.2。微氧发酵0.5-1h后，静置分层。本专利技术步骤（2）中，静置分层后，抽取发酵体积50%～80%的上层清液进行分离处理，可以直接进行1,3-丙二醇提取精制，或者待发酵过程结束后收集所有上层清液统一进行分离处理。本专利技术步骤（2）中，抽取上层清液后，同时向发酵体系中加入上层清液体积85%～90%的新鲜培养基。新鲜培养基可以采用发酵培养基，优选以下配方的补充培养基：NH4Cl4.26g/L、KCl0.2g/L、NaH2PO4·H2O2.07g/L、MgCl2·6H2O0.26g/L、柠檬酸0.42g/L、酵母膏1.5g/L、Vc0.15g/L、甘油40g/L。本专利技术步骤（2）中，加入新鲜培养基后控制发酵体系pH至偏碱性，采用的试剂为氢氧化钠、氢氧化钾等，使发酵体系pH为7.0～8.0，优选为7.2～7.5。随后维持0.5～2h，进行厌氧发酵，重复多次，以实现连续发酵。与现有技术相比，本专利技术方法具体如下有益效果：（1）在发酵培养基中添加阳离子型生物多糖基聚合物，随着发酵体系中乙酸浓度的增加，能够形成带电高分子聚合体，使发酵菌体形成菌团，在发酵罐中易于与发酵液进行分离。同时结合发酵节点pH的调控，可以迅速实现固液分离，排出发酵清液的同时发酵菌种会以固体形式存在于发酵罐中，从而实现了发酵菌种的重复利用，达到了连续发酵的目的。（2）针对甘油氧化途径中副产有机酸较多的特征，对发酵过程进行厌氧-微氧-厌氧的重复切换，从而利用其代谢途径诱导形成细胞固定条件，提高生产效率。（3）新鲜培养基不需要添加阳离子型生物多糖基聚合物，仅需投加一次，即可多次使用，进一步提高生产效率。（4）本专利技术方法解决了批本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物连续生产1,3‑丙二醇的方法，其特征在于包括如下内容：（1）菌种培养：以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；（2）连续发酵：a、在发酵培养基中接入发酵种子液；b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油；c、至发酵液中1,3‑丙二醇浓度大于60g/L，转换至微氧发酵，发酵过程中控制发酵体系pH至偏酸性，静置分层后，抽取上层清液，同时加入新鲜培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后重复步骤b、c，以实现连续发酵。

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于包括如下内容：（1）菌种培养：以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；（2）连续发酵：a、在发酵培养基中接入发酵种子液；b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油；c、至发酵液中1,3-丙二醇浓度大于60g/L，转换至微氧发酵，发酵过程中控制发酵体系pH至偏酸性，静置分层后，抽取上层清液，同时加入新鲜培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后重复步骤b、c，以实现连续发酵。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述发酵菌为能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的兼性厌氧菌，如克雷伯杆菌（Klebsiellapneumoniae）或弗氏柠檬杆菌（Citrobacterfreundii）。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）将活化的发酵菌液接种至种子培养基中，接种体积比为1%～30%，优选5%～15%；培养温度为20～40℃，优选35～40℃；搅拌转速为100～500rpm，优选200～400rpm。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）在微氧条件下培养，所述微氧条件是在培养过程无气体通入的发酵模式。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）发酵种子液的接种体积比为1%～30%，优选5%～15%。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的发酵培养基中添加阳离子型生物多糖基聚合物，添加质量浓度为0.1%～1.0%。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述阳离子型生物多糖基聚合物为氨基多糖聚合物或淀粉基聚合物，添加质量浓度为0.1%～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张霖，樊亚超，孙启梅，李晓姝，廖莎，师文静，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11