一种木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种木霉属真菌挥发物的收集与鉴定方法，涉及木霉属真菌挥发物检测技术领域。本发明专利技术采用改进后的固相微萃取SPME富集木霉属真菌挥发物，然后采用气相色谱‑质谱GC‑MS检测木霉属真菌挥发物组分。解决了现有技术中由于木霉属真菌挥发物量少，收集难，以致于检测不到挥发物组分或检测到的挥发物组分种类甚少的问题。本发明专利技术快速准确地测定木霉属真菌挥发物真实的化学信息，为后续开展昆虫学实验提供全面可信的数据，有利于动态监测和防治地下害虫，同时为研究木霉属真菌与其它生物的互作关系提供理论基础。

A Method for Collection and Identification of Volatile Compounds from Trichoderma Fungi

The embodiment of the invention discloses a method for collecting and identifying volatiles of Trichoderma fungi, which relates to the technical field of detecting volatiles of Trichoderma fungi. The improved solid phase microextraction SPME is used to enrich Trichoderma fungal volatiles, and then gas chromatography-mass spectrometry GC-MS is used to detect Trichoderma fungal volatiles. In the prior art, due to the low volatile content of Trichoderma fungi and the difficulty of collection, the volatile components can not be detected or the types of volatile components detected are very few. The invention can quickly and accurately determine the true chemical information of Trichoderma fungi volatiles, provide comprehensive and credible data for subsequent entomological experiments, facilitate dynamic monitoring and control of underground pests, and provide theoretical basis for studying the interaction between Trichoderma fungi and other organisms.

【技术实现步骤摘要】
一种木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法
本专利技术实施例涉及木霉属真菌挥发物检测
，具体涉及一种木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法。
技术介绍
木霉属(Trichoderma)真菌在分类上隶属于半知菌类、丛梗孢目、丛梗孢科、丛梗孢科单胞亚科、头孢霉族，主要存在于森林、坡沟、农田、草地等潮湿的生态环境中，土壤、枯枝落叶腐木等植物残体以及其它真菌的子实体都是其生长基物。木霉属真菌对植物病原真菌具有拮抗和重寄生等作用，被广泛用于各种植物真菌病害的防治，在农业生产中发挥着重要作用。本专利技术人团队在从事昆虫与微生物相互作用的研究中，发现地下害虫对富含木霉属真菌的土壤具有强烈的趋性，深入研究表明木霉属真菌挥发物起着重要作用，基于这一重大发现，利用地下害虫对木霉属真菌挥发物的趋性进行地下害虫的诱捕，可以应用于农业生产地下害虫防治中，相比于其它的防治方法，物理诱捕无污染，无残留，减少环境污染。因此快速准确测定木霉属真菌挥发物的化学成分有利于动态监测和防治地下害虫，同时为研究木霉属真菌与其它生物的互作关系提供理论基础。固相微萃取联合气相色谱质谱仪连用技术(solid-phasemicroextractionandgaschromatographymassspectroscopy，SPME/GC-MS)是通过石英纤维头表面涂渍的高分子层对顶空气体中的挥发物进行富集提取，然后通过气相色谱质谱联用仪(GC-MS)对挥发物进行分离、鉴定，具有不用或少用溶剂；操作简便；分析速度快以及灵敏度高的优点。微生物产生的挥发物具有排放量小、浓度低的特点，因此，SPME/GC-MS是一种可用于收集和鉴定微生物挥发物的有效方法。本专利技术人团队在木霉属真菌挥发物的收集和鉴定研究过程中，发现木霉属真菌挥发物量小(痕量)，收集难，以致于即使采用现有SPME/GC-MS也存在检测不到挥发物组分或检测到的挥发物组分种类甚少的问题，使得检测结果不能全面客观地反映木霉属真菌挥发物的真实的化学信息。因此，有必要研发出一种新的收集和鉴定木霉属真菌挥发物的方法，以实现木霉属真菌挥发物检测结果的准确度和可靠性。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种操作方便、快速准确有效的木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，以解决现有技术中由于木霉属真菌挥发物量少而导致的收集难、检测不到挥发物组分或检测到的挥发物组分种类少的问题，本专利技术为研究木霉属真菌与土栖生物的关系提供一定的理论基础，同时有利于动态监测和防治对木霉属真菌具有趋性的地下害虫。为了实现上述目的，本专利技术的实施方式提供如下技术方案：在本专利技术的实施方式的第一方面中，提供了一种木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，包括以下步骤：1)将木霉属真菌接种到含有培养基的培养皿中，用密封胶带密封培养皿；2)将培养皿放入培养箱中培养到真菌长出菌丝和孢子；3)在培养皿中加入无菌水，使用无菌涂布棒将菌丝和孢子转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，用锡箔纸和密封胶带密封棕色气密萃取瓶；4)采用固相微萃取技术收集萃取瓶中的挥发物，使用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对挥发物进行化学成分的分离和鉴定。进一步地，所述方法包括以下步骤：1)将木霉属真菌接种到含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的培养皿中，用密封胶带密封培养皿，将培养皿放入培养箱中培养到真菌长出菌丝和孢子，与此同时，相同的培养条件下，不接种木霉属真菌的培养基作为对照；2)对照组挥发物收集：在超净工作台中，向没有接种木霉属真菌的培养皿中加入无菌水，用无菌涂布棒轻刮培养基斜面，将溶液转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，锡箔纸盖住瓶口，再用密封胶带密封，将萃取头安装在萃取手柄上，萃取头穿过锡箔纸插入棕色气密萃取瓶中，推动萃取手柄使石英纤维暴露于溶液上方空气中，收集对照组挥发物；3)木霉属真菌挥发物收集：在超净工作台中，向培养好的木霉属真菌的培养皿中加入无菌水，用无菌涂布棒将培养基上的木霉属真菌的菌丝和孢子轻轻刮下，将悬浮液转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，锡箔纸盖住瓶口，再用密封胶带密封，将萃取头安装在萃取手柄上，萃取头穿过锡箔纸插入棕色气密萃取瓶中，推动萃取手柄使石英纤维暴露于悬浮液上方空气中，收集木霉属真菌挥发物；4)挥发物鉴定：将萃取头连入气相色谱-质谱联用仪，进行气相色谱-质谱分析，通过与数据库进行检索对照，鉴定出挥发物中每一组分的结构。其中，所述无机盐包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化铵、氯化钾、溴化钾中的一种或多种。无机盐在不破坏木霉属真菌活体物质的条件下，改变了真菌细胞壁的通透性和渗透压，使得木霉属真菌产生更多的挥发物，增加挥发物在石英纤维的富集量，有利于微量成分的收集与检测，进而提高木霉属真菌挥发物测定结果的准确率和可靠性。无机盐的添加量以在溶液/悬浮液中达到一定的浓度为宜，在一个优选的实施例中，无机盐的添加量为溶液/悬浮液达到饱和状态。在一个更优选的实施例中，所述无机盐为氯化钠。在挥发物收集的步骤中，为避免萃取头与溶液/悬浮液直接接触，将石英纤维置于溶液/悬浮液表面上方10-15mm处。为了提高挥发物的富集速度及富集量，同时木霉属真菌的活体物质不被破坏，萃取过程中，将棕色气密萃取瓶置于35-45℃的恒温水浴锅35-50分钟，在一个优选的实施例中，恒温水浴锅的水温为40℃，萃取时间为40分钟。进一步地，所述木霉属真菌包括长柄木霉(Trichodermalongibranchiatum)、哈茨木霉(T.harzianum)、绿色木霉(T.viride)、钩状木霉(T.hamatum)、拟康氏木霉(T.reesei)、康宁木霉(T.koningii)、深绿木霉(T.atroviride)、里氏木霉(T.pseudokoningii)和卷曲木霉(T.spirale)。进一步地，所述培养基的制作方法为：将36g马铃薯、3.6g葡萄糖、2.7g琼脂和1000ml纯净水混合，在高压灭菌锅中以121℃高压灭菌20min，趁培养基未冷却凝固，将培养基倒入培养皿中，冷却备用。进一步地，所述木霉属真菌的培养方法为：用无菌涂布棒将木霉属真菌以“Z”字型接种于培养基上，用密封胶带密封培养皿，然后将培养皿放入28℃的恒温培养箱中，在全光照环境下培养3-7天，待真菌的菌丝和孢子长满培养皿。研究表明，本专利技术公开的上述任一木霉属真菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养，均能够很好地生长。进一步地，所述气相色谱-质谱分析条件：色谱柱：DB-1毛细管柱，柱长×内径×膜厚＝10m×0.05mm×0.05μm；载气：高纯氦气；进样方式设置为无分流进样，流速为1mL/min；进样口温度为250℃；程序升温：50℃保持5min，以5℃/min升温至230℃，最后保持19min；电子碰撞解离设置为70eV，采用电子轰击(EI)方式，质谱设置为全扫描，扫描范围为30-400amu。基于分析结果，验证保留时间和质谱数据，并与美国国家标准与技术研究院(NIST)数据库进行检索对照，鉴定出挥发物中每一组分的结构，使用归一化方法从总离子电流峰值计算每个峰面积，得到每一挥发性组分的相对含量。在本专利技术的实施方式的第二方面中，提供了一种由上述的收集和鉴定方法得到的木霉属真菌挥发物，所述挥发物包括1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-乙基-己醇、苯乙酮本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将木霉属真菌接种到含有培养基的培养皿中，用密封胶带密封培养皿；2)将培养皿放入培养箱中培养到真菌长出菌丝和孢子；3)在培养皿中加入无菌水，使用无菌涂布棒将菌丝和孢子转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，用锡箔纸和密封胶带密封棕色气密萃取瓶；4)采用固相微萃取技术收集萃取瓶中的挥发物，使用气相色谱‑质谱(GC‑MS)联用技术对挥发物进行化学成分的分离和鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将木霉属真菌接种到含有培养基的培养皿中，用密封胶带密封培养皿；2)将培养皿放入培养箱中培养到真菌长出菌丝和孢子；3)在培养皿中加入无菌水，使用无菌涂布棒将菌丝和孢子转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，用锡箔纸和密封胶带密封棕色气密萃取瓶；4)采用固相微萃取技术收集萃取瓶中的挥发物，使用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对挥发物进行化学成分的分离和鉴定。2.根据权利要求1所述的木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将木霉属真菌接种到含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的培养皿中，用密封胶带密封培养皿，将培养皿放入培养箱中培养到真菌长出菌丝和孢子，与此同时，相同的培养条件下，不接种木霉属真菌的培养基作为对照；2)对照组挥发物收集：在超净工作台中，向没有接种木霉属真菌的培养皿中加入无菌水，用无菌涂布棒轻刮培养基斜面，将溶液转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，锡箔纸盖住瓶口，再用密封胶带密封，将萃取头安装在萃取手柄上，萃取头穿过锡箔纸插入棕色气密萃取瓶中，推动萃取手柄使石英纤维暴露于溶液上方空气中，收集对照组挥发物；3)木霉属真菌挥发物收集：在超净工作台中，向培养好的木霉属真菌的培养皿中加入无菌水，用无菌涂布棒将培养基上的木霉属真菌的菌丝和孢子轻轻刮下，将悬浮液转移到棕色气密萃取瓶中，添加无机盐，锡箔纸盖住瓶口，再用密封胶带密封，将萃取头安装在萃取手柄上，萃取头穿过锡箔纸插入棕色气密萃取瓶中，推动萃取手柄使石英纤维暴露于悬浮液上方空气中，收集木霉属真菌挥发物；4)挥发物鉴定：将萃取头连入气相色谱-质谱联用仪，进行气相色谱-质谱分析，通过与数据库进行检索对照，鉴定出挥发物中每一组分的结构。3.根据权利要求1所述的木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化铵、氯化钾、溴化钾中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的木霉属真菌挥发物的收集和鉴定方法，其特征在于，所述木霉属真菌包括长柄木霉(Trichodermalongibranchiatum)、哈茨...

【专利技术属性】
技术研发人员：文超，王偲，熊鸿鹏，温秀军，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44