一种生物法制备覆盆子酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物法制备覆盆子酮的方法，包括在大肠杆菌中同时诱导表达植物来源的4‑香豆酰辅酶A连接酶、苄基丙酮合酶和苄基丙酮还原酶。本发明专利技术在生物合成覆盆子酮的代谢途径上新添加了苄基丙酮还原酶(RiRZS1)，增加了中间产物对羟基亚苄基丙酮的转化效率。此外，摇瓶发酵覆盆子酮的产量达到了70.62mg/L，进一步用生物合成法显著提高了覆盆子酮的产量。

Preparation of raspberry ketone by biological method

The invention discloses a biological method for preparing raspberry ketone, which includes inducing and expressing plant-derived 4 coumarin acyl coenzyme A ligase, benzylacetone synthase and benzylacetone reductase simultaneously in E. coli. The invention adds a new benzylacetone reductase (RiRZS1) to the metabolic pathway of the biosynthesis of raspberry ketone, and increases the conversion efficiency of the intermediate product p-hydroxybenzylidene acetone. In addition, the production of raspberry ketone reached 70.62 mg/L by shaking flask fermentation, and the production of raspberry ketone was significantly increased by biosynthesis.

【技术实现步骤摘要】
一种生物法制备覆盆子酮的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种生物法制备覆盆子酮的方法。
技术介绍
覆盆子酮，又称为悬钩子酮，是覆盆子果的主要香气成分，具有特征性甜果香气。存在于覆盆子、黑莓、葡萄和大黄等水果与蔬菜中。覆盆子酮的用途具有多样性，作为香型香精、修饰剂或定香剂，大量用于日用香料、食品香料、日化香精、烟用香精及化妆品中。另外覆盆子酮作为一种精细化工的中间体，可用于药物、染料和农药的合成。现如今覆盆子酮在香料工业中，已成为仅次于香兰素的一种具有极高经济价值的香料。覆盆子酮的制备方法主要有三种，植物提取法、化学合成法和生物合成法，由于植物中含量极低，只有0.11-0.12mg/kg，因此从植物中提取的方法成本很高，所以目前工业生产主要以化学合成法为主。化学合成法从原料来源和用途上分为以石油化工原料合成的覆盆子酮和以天然等同物大茴香醛合成的覆盆子酮。以石油化工原料合成覆盆子酮主要有4种：(1)以苯酚和甲基乙烯基酮为原料来合成覆盆子酮。(2)以苯酚和4-丁醇-2-酮作为原料，在酸催化下进行烷基化反应，生成覆盆子酮。此方法使用原料丁醇酮，可以避免使用毒性较大的甲基乙烯基酮。(3)将乙酰乙酸乙酯在对甲氧基节氯的α-烷基取代后，进行酮式分解得到4-对甲氧基苯基-2-丁酮。在浓氢溴酸作用下，醚键断裂，最后生成4-对羟基苯基-2-丁酮(英国专利GB1094417)。(4)羟基苯甲醛与丙酮进行Claisen-Schmidt缩合，然后加氢还原，再经减压蒸馏和重结晶等后处理获得理想纯度的覆盆子酮(中国专利CN1097729)。虽然化学合成法价格低廉、产量很高，但是得到的产品其香气往往不能满足高档的日化香精和食用香精要求，只能在日化香精的调配和作为合成昆虫引诱剂的原料使用，同时，这些方法还存在环境污染、设备腐蚀、收率低及后处理难等问题亟待解决。中国专利CN200910114390.4公布了一种由天然等同物大茴香醛合成覆盆子酮的新方法。以天然等同物大茴香醛为原料,经三步工艺即可制备得到覆盆子酮,工艺条件温和,反应收率可达67.5％,产品较其它合成型覆盆子酮香型更为清香,留香更为持久。由大茴香醛合成的覆盆子酮香气和天然提取的覆盆子酮相近，可用于高档的日化香精和食品香精的配方中，但这种半合成方法依赖于大茴香醛原料的供给。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。因此，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种生物法制备覆盆子酮的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种生物法制备覆盆子酮的方法，其包括，在大肠杆菌中同时诱导表达植物来源的4-香豆酰辅酶A连接酶、苄基丙酮合酶和苄基丙酮还原酶。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案，其包括，将4-香豆酰辅酶A连接酶的基因与苄基丙酮合酶的基因在质粒pACYC-Duet-1上进行共表达，得到表达载体pACYC-BAS-4CL；将苄基丙酮还原酶的RiRZS1基因在质粒pET-Duet-1上进行表达，得到表达载体pET-RZS1；将表达载体pACYC-BAS-4CL、pET-RZS1同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Mu1。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶的基因4CL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其来源于植物欧芹(Petroselinumcrispum)并经过密码子优化；编码所述苄基丙酮合酶的基因BAS的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，来源于植物掌叶大黄(Rheumpalmatum)并经过密码子优化；编码所述苄基丙酮还原酶的基因RiRZS1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，来源于植物覆盆子(Raspberryketone)，并经过密码子优化。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：还包括，将所述重组大肠杆菌Mu1通过IPTG诱导培养，添加对香豆酸发酵产覆盆子酮。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：所述得到表达载体pACYC-BAS-4CL，包括先用EcoRI和HindIII双酶切质粒pACYC-Duet-1与PCR克隆得到的4-香豆酰辅酶A连接酶基因通过一步克隆获得重组质粒pACYC-4CL，之后用KpnI和XhoI双酶切质粒pACYC-4CL与PCR克隆得到的苄基丙酮合酶基因通过一步克隆获得重组质粒pACYC-BAS-4CL。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：用BglII和KpnI双酶切质粒pET-Duet-1与PCR克隆得到的苄基丙酮还原酶基因通过一步克隆获得重组质粒pET-RZS1。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：将质粒pACYC-BAS-4CL、pET-RZS1用热击法同时导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌Mu1。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：将重组大肠杆菌Mu1活化后转接到种子LB培养基中，并添加10～30mg/mL氯霉素及50～100mg/mL氨苄青霉素，以180～300rmp的转速在20～37℃过夜培养，之后以5％的接种量接种到新鲜的发酵培养基中，添加10～30mg/mL氯霉素及50～100mg/mL氨苄青霉素，于20～37℃培养到OD600为1.0～1.2时，添加终浓度为0.1～1mM的IPTG及底物，于20～37℃继续培养至72h。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：所述对香豆酸添加到发酵培养基中的终浓度为100～150mg/L。作为本专利技术所述的生物法制备覆盆子酮的方法的一种优选方案：所述发酵培养基，包括TB培养基，其组分包括8～15g/L蛋白胨、15～30g/L酵母膏、1～5g/L甘油、1～5g/LKH2PO4、5～15g/LK2HPO4、5～10g葡萄糖。本专利技术的有益效果：本专利技术在生物合成覆盆子酮的代谢途径上新添加了苄基丙酮还原酶(RiRZS1)，增加了中间产物对羟基亚苄基丙酮的转化效率。此外，摇瓶发酵覆盆子酮的产量达到了70.62mg/L，进一步用生物合成法显著提高了覆盆子酮的产量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为本专利技术覆盆子酮生物合成途径示意图。图2为本专利技术质粒pACYC-BAS-4CL与pET-RZS1示意图。图3本专利技术产物覆盆子酮GC-MS图。图4为本专利技术中不同培养基对覆盆子酮的产量影响具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物法制备覆盆子酮的方法，其特征在于：包括，在大肠杆菌中同时诱导表达植物来源的4‑香豆酰辅酶A连接酶、苄基丙酮合酶和苄基丙酮还原酶。

【技术特征摘要】
1.一种生物法制备覆盆子酮的方法，其特征在于：包括，在大肠杆菌中同时诱导表达植物来源的4-香豆酰辅酶A连接酶、苄基丙酮合酶和苄基丙酮还原酶。2.如权利要求1所述的生物法制备覆盆子酮的方法，其特征在于：包括，将4-香豆酰辅酶A连接酶的基因与苄基丙酮合酶的基因在质粒pACYC-Duet-1上进行共表达，得到表达载体pACYC-BAS-4CL；将苄基丙酮还原酶的RiRZS1基因在质粒pET-Duet-1上进行表达，得到表达载体pET-RZS1；将表达载体pACYC-BAS-4CL、pET-RZS1同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Mu1。3.如权利要求1或2所述的生物法制备覆盆子酮的方法，其特征在于：编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶的基因4CL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，来源于植物欧芹(Petroselinumcrispum)，并经过密码子优化；编码所述苄基丙酮合酶的基因BAS的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，来源于植物掌叶大黄(Rheumpalmatum)，并经过密码子优化；编码所述苄基丙酮还原酶的基因RiRZS1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，来源于植物覆盆子(Raspberryketone)，并经过密码子优化。4.如权利要求2所述的生物法制备覆盆子酮的方法，其特征在于：还包括，将所述重组大肠杆菌Mu1通过IPTG诱导培养，添加对香豆酸发酵产覆盆子酮。5.如权利要求1、2或4任一所述的生物法制备覆盆子酮的方法，其特征在于：所述得到表达载体pACYC-BAS-4CL，包括先用EcoRI和HindIII双酶切质粒pACYC-Duet-1与PCR克隆得到的4-香豆酰辅酶A连...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑璞，王程程，陈鹏程，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32