液滴加标的相邻性保留的标签化DNA制造技术

提供了用于保持测序的DNA相邻性的组合物和方法。

Labeled DNA retained by adjacency of droplet labeling

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】液滴加标的相邻性保留的标签化DNA相关申请的交叉引用本申请要求2016年12月19日提交的美国临时专利申请号62/436,288的优先权，该文通过引用纳入本文。
技术介绍
单倍型信息在许多遗传分析中可能是有价值的。然而，由于不能保持相邻性，因此很难从许多测序方法中获得关于单倍型的信息。Amini等NatureGenetics46(12):1343-1349描述了保持相邻性的一种方法，但是该方法包括许多单独的反应，各反应需要显著的酶(例如，标签酶(tagmentase))。
技术实现思路
在一些实施方式中，提供了确定单倍型基因组序列的方法。在一些实施方式中，该方法包括：提供基因组DNA的片段；将片段与载有衔接体的标签酶反应，所述载有衔接体的标签酶产生由片段中断裂点限定的DNA片段并在断裂点插入衔接体，其中该反应处于标签酶结合断裂点以形成连接的DNA区段的条件下，所述连接的DNA区段处于DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体-(DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体)n-DNA区段的形式，其中n是任何整数并且“-”表示共价连接；将连接的DNA区段包封在分区(partition)中，所述分区包含：珠，该珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过正向引物寡核苷酸的5'端与珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与第一或第二衔接体互补的3'端，其中正向引物3'端和反向引物3'端与选自第一衔接体和第二衔接体的不同衔接体互补；置换分区中区段的标签酶；进行扩增，其中正向引物和反向引物寡核苷酸由DNA区段生成扩增子，从而使分区内的扩增子被珠条码条码化；合并分区以形成包含扩增子的反应混合物；和对扩增子进行核苷酸测序。在一些实施方式中，分区包含一定量的试剂，所述试剂从区段置换出标签酶但是不抑制聚合。在一些实施方式中，该试剂是聚合酶。在一些实施方式中，该试剂是去污剂。在一些实施方式中，将标签酶热置换。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，扩增之前，插入的衔接体的单链区被DNA聚合酶填平。在一些实施方式中，该填平在过程中从区段置换出标签酶。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，扩增之前，片段化的靶核酸的单链区被合并上述任何实施方式的DNA聚合酶填平。在一些实施方式中，正向引物寡核苷酸由珠释放，并且扩增发生在溶液中。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，试剂是去污剂。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，SDS的浓度是0.005-0.05％(例如，0.01-0.04％，例如，0.01-0.02％)。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，片段平均为5-10Mb。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，分区是乳液中的液滴。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，包封将平均0.02-3(例如，0.05-1，0.08-0.5，例如，0.1、1、2或3)个珠包封于分区中。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，基因组DNA来自单细胞。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，基因组DNA来自哺乳动物或植物。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体具有不同的序列。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体具有5’突出端序列，并且该5’突出端序列的相同性小于50％。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体具有相同的序列。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，当第一衔接体和第二衔接体加载到连接酶时，其通过连接序列连接，从而使DNA区段通过标签酶和连接序列两者连接。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，连接序列包含限制性识别序列，并且连接序列在包封之后和进行扩增之前被限制酶切割。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，连接序列包含一个或多个尿嘧啶，并且连接序列在包封之后和进行扩增之前被尿嘧啶-DNAN-糖基化酶切割。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，连接序列包含一个或多个核糖核苷酸，并且连接序列在包封之后和进行扩增之前在核糖核苷酸处被切割。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，n是选自0-10,000的整数。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体-(DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体)n-DNA的长度为5kb-10Mb，例如，1Mb-10Mb。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，至少10,000个不同的连接的DNA区段被包封于不同的分区中。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，标签酶与固体支持物连接。例如，在一些实施方式中，固体支持物是与连接正向引物的珠不同的珠。还提供了多种分区。在一些实施方式中，分区包含：珠，该珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过正向引物寡核苷酸的5'端与珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；和反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与第一或第二衔接体互补的3'端，其中正向引物3'端和反向引物3'端与选自第一衔接体和第二衔接体的不同衔接体互补。在一些实施方式中，分区包含一定量的试剂，所述试剂从DNA置换出标签酶但是不抑制聚合。在一些实施方式中，分区还包含：标签酶；和基因组DNA，其中DNA的区段具有由衔接体限定的末端，所述衔接体插入在由标签酶产生的断裂点，处于第一衔接体-DNA区段-第二衔接体的形式。在一些实施方式中，该试剂是去污剂。在一些实施方式中，所述去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中，SDS的浓度是0.005-0.05％(例如，0.01-0.04％，例如，0.01-0.02％)。在一些实施方式中，分区是乳液中的液滴。在一些实施方式中，分区包含平均0.02-3(例如，0.05-1，0.08-0.5，例如，0.1、1、2或3)个珠。在一些实施方式中，基因组DNA来自单细胞。在一些实施方式中，基因组DNA来自哺乳动物或植物。在一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体具有不同的序列。在一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体的相同性小于50％。在一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体具有相同的序列。在一些实施方式中，第一衔接体和第二衔接体通过连接序列连接，以包含第一衔接体-DNA区段-第二衔接体-(接头序列)-第一衔接体-DNA区段-第二衔接体)n的形式，其中n是1或更大的任何整数。在一些实施方式中，连接序列包含限制性识别序列，并且任选地，分区还包含限制性识别序列限制酶。在一些实施方式中，连接序列包含一个或更多个尿嘧啶，并且任选地，分区还包含尿嘧啶-DNAN-糖基化酶。在一些实施方式中，连接序列包含一个或更多个核糖核苷酸。在一些实施方式中，n是选自1-10,000的整数。在一些实施方式中，第一衔接体-DNA区段-第二衔接体-(接头序列-第一衔接体-DNA区段-第二衔接体)n的长度为5kb-10Mb，例如，1Mb-10Mb。在一些实施方式中，多个分区包含至少10,000个不同的分区。在一些实施方式中，标签酶连接固体支持物。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定单倍型基因组序列信息的方法，所述方法包括：提供基因组DNA的片段；将所述片段与载有衔接体的标签酶反应，所述载有衔接体的标签酶产生由片段中断裂点限定的DNA片段并在所述断裂点插入衔接体，其中所述反应处于使得所述标签酶结合所述断裂点以形成连接的DNA区段的条件下，所述连接的DNA区段为DNA区段‑第一衔接体‑标签酶‑第二衔接体‑(DNA区段‑第一衔接体‑标签酶‑第二衔接体)n‑DNA区段的形式，其中n是任何整数并且“‑”表示共价连接；将连接的DNA区段包封在分区中，所述分区包含：珠，所述珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过所述正向引物寡核苷酸的5'端与所述珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对所述第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与所述第一或第二衔接体互补的3'端，其中所述正向引物3'端和所述反向引物3'端与选自所述第一衔接体和所述第二衔接体的不同衔接体互补；从所述分区中的所述区段置换出所述标签酶；进行扩增，其中所述正向引物和所述反向引物寡核苷酸由所述DNA区段生成扩增子，从而用所述珠条码条码化分区内的扩增子；合并所述分区以形成包含所述扩增子的反应混合物；和对扩增子进行核苷酸测序。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.19 US 62/436,2881.一种确定单倍型基因组序列信息的方法，所述方法包括：提供基因组DNA的片段；将所述片段与载有衔接体的标签酶反应，所述载有衔接体的标签酶产生由片段中断裂点限定的DNA片段并在所述断裂点插入衔接体，其中所述反应处于使得所述标签酶结合所述断裂点以形成连接的DNA区段的条件下，所述连接的DNA区段为DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体-(DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体)n-DNA区段的形式，其中n是任何整数并且“-”表示共价连接；将连接的DNA区段包封在分区中，所述分区包含：珠，所述珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过所述正向引物寡核苷酸的5'端与所述珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对所述第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与所述第一或第二衔接体互补的3'端，其中所述正向引物3'端和所述反向引物3'端与选自所述第一衔接体和所述第二衔接体的不同衔接体互补；从所述分区中的所述区段置换出所述标签酶；进行扩增，其中所述正向引物和所述反向引物寡核苷酸由所述DNA区段生成扩增子，从而用所述珠条码条码化分区内的扩增子；合并所述分区以形成包含所述扩增子的反应混合物；和对扩增子进行核苷酸测序。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述分区包含一定量的试剂，所述试剂从所述区段置换出所述标签酶但是不抑制聚合。3.如权利要求1所述的方法，其中，在扩增之前，插入的衔接体的单链区被DNA聚合酶填平。4.如权利要求1所述的方法，其中，在扩增之前，片段化的靶核酸的单链区被DNA聚合酶填平。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述正向引物寡核苷酸由所述珠释放，并且扩增发生在溶液中。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述试剂是去污剂。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述SDS的浓度是0.005-0.05％(例如，0.01-0.04％，例如，0.01-0.02％)。9.如权利要求1所述的方法，其中，所述片段平均为5-10Mb。10.如权利要求1所述的方法，其中，所述分区是乳液中的液滴。11.如权利要求1所述的方法，其中，所述包封将平均0.02-3(例如，0.05-1，0.08-0.5，例如，0.1、1、2或3)个珠包封于分区中。12.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因组DNA来自单细胞。13.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因组DNA来自哺乳动物或植物。14.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接体和所述第二衔接体具有不同的序列。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述第一衔接体和所述第二衔接体的相同性小于50％。16.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接体和所述第二衔接体具有相同的序列。17.如权利要求1所述的方法，其中，当所述第一衔接体和所述第二衔接体加载到所述连接酶时，所述第一衔接体和所述第二衔接体通过连接序列连接，从而使所述DNA区段通过所述标签酶和所述连接序列两者连接。18.如权利要求17所述的方法，其中，所述连接序列包含限制性识别序列，并且所述连接序列在包封之后和进行扩增之前被限制酶切割。19.如权利要求17所述的方法，其中，所述连接序列包含一个或更多个尿嘧啶，并且所述连接序列在包封之后和进行扩增之前被尿嘧啶-DNAN-糖苷酶切割。20.如权利要求17所述的方法，其中，所述连接序列包含一个或更多个核糖核苷酸，并且所述连接序列在包封之后和进行扩增之前在所述核糖核苷酸处被切割。21.如权利要求1所述的方法，其中，n是选自0-10,000的整数。22.如权利要求1所述的方法，其中，所述DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体-(DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体)n-DNA区段的长度为5kb-10Mb，例如，1Mb-10Mb。23.如权利要求1所述的方法，其中，至少10,000个不同的连接的DNA区段被包封于不同的分区中。24.多个划分产物，所述划分产物包含：珠，所述珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过所述正向引物寡核苷酸的5'端与所述珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与所述第一或第二衔接体互补的3'端，其中所述正向引物3'端...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·雷伯弗斯基，J·阿格蕾丝蒂，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US