一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提取试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提取试剂盒，试剂盒包括如下试剂：裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附缓冲液，洗涤液，TE洗脱液；氨基酸吸附缓冲液包括：80‑200mM氨基酸，0.1‑0.3M离液盐，5％‑15％PEG，0.5‑1.2M氯化钠，40‑100mM Tris‑HCl，20‑50mM EDTA，pH 2.1‑2.4；本发明专利技术通过将氨基酸与低浓度的离液盐结合，控制缓冲液的pH值，提高提取效率；使用PEG降低DNA剪切力损伤，保证DNA的完整性；从而使得血浆游离DNA的提取无抑制剂残留、提取质量高、操作简便、成本低廉。

A Kit for Extracting Free DNA from Amino Acid Buffer and Plasma

【技术实现步骤摘要】
一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提取试剂盒
本专利技术涉及生物医药，生物样本前处理
，特别是一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提取试剂盒。
技术介绍
cfDNA是一种片段化的胞外DNA，主要存在于血浆、血清、脑脊液等体液中，长度在几十到几百个碱基。目前cfDNA主要应用领域是无创产前诊断和肿瘤液态活检。随着cfDNA应用越来越广泛，cfDNA的提取显得十分重要，cfDNA的提取包括核酸与蛋白质的分离、核酸的吸附、去除蛋白等杂质、核酸洗脱。目前提取cfDNA多使用酚-氯仿法、磁珠法和硅胶膜吸附柱法。酚-氯仿等试剂对人体有伤害，且提取效率低、重复性差。磁珠法通常是在磁珠表面修饰不同的配体，如抗体、抗原、寡核苷酸或适配体，这些配体与样品中的目标特异性结合。然后，在容器或管的一侧施加磁铁，对磁珠进行吸附，经过洗涤、洗脱，得到纯化的核酸。磁珠提取技术可用于多种样本的批量处理，是自动化、高通量的最佳选择之一，但是核酸纯度较低，常影响下游应用(酶切、PCR等)。硅胶膜吸附柱法是结合特定的缓冲溶液、精确的pH和盐浓度实现对核酸的吸附。研究发现，在酸性条件下，硅基质对DNA具有较高的结合亲和力，且随着盐浓度增加而增加，这项技术涉及的机制是带负电荷的核酸和带正电荷的二氧化硅材料之间的亲和力，导致核酸选择性地结合到二氧化硅基质上，而细胞的其余成分和其他化学物质则被冲走。该方法快速、核酸纯度高、重现性好，其主要缺点是对小片段核酸的提取效率较磁珠法低，且常用离液盐条件，对后续的盐分洗涤比较繁琐、冗长。柱提法还存在的一个严重的问题是高速离心造成的剪切力，容易降解DNA，影响DNA的完整性。目前市场上主要的硅胶膜吸附柱法提取游离核酸的产品是Qiagen公司的试剂盒，不但价格较昂贵，而且回收率仅约40％。因此中国市场急切地需要一种无毒无害、无抑制剂残留、不影响DNA结构、价格廉价、高提取率、高品质的cfDNA提取试剂盒。二氧化硅表面的类型在吸附的DNA总量中起着重要作用，对于给定的二氧化硅表面，带正电荷的氨基酸促进DNA吸附，而带负电的氨基酸几乎没有促进作用。核酸的有效洗脱与吸附同样重要，在较高的pH条件可通过增加二氧化硅表面上的负电荷密度，增加DNA和二氧化硅表面之间的静电排斥，从而促进DNA洗脱。有研究显示，氨基酸缓冲液与高浓度离液盐的作用相当，但是没有明确的文献阐述氨基酸结合低浓度离液盐在促进核酸吸附中的作用。PEG的性质稳定，无毒无害，耐热、酸碱，具有润滑性和粘结性。根据分子不同具有不同的物理性质，分子量在700及以下的PEG呈无色无味、粘稠状，可使用不同相对分子质量的PEG改变溶剂的粘度(Mr<2000)，作为粘度调节剂。聚乙二醇水溶液的粘度对剪切速率较敏感，细菌不易在聚乙二醇上生长。PEG可诱导水溶液中大分子的聚集，增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解，同时具有沉淀核酸的作用，常用于沉淀病毒颗粒，还不曾用于cfDNA的提取。针对上述存在技术难题，本专利技术创新性地探究氨基酸与低浓度的离液盐结合，同时严格控制缓冲液的pH值对提高提取效率的影响；探究低分子量聚乙二醇在降低DNA剪切力损伤中的作用。为市场寻找到一种提取方法可以替代高浓度离液盐条件并可以高效地促进硅胶膜对小片段DNA的捕获能力，增大cfDNA提取效率，同时保证DNA的完整性，无抑制剂残留、提取的cfDNA质量高、操作简便、成本低廉。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提取试剂盒，通过将氨基酸与低浓度的离液盐结合，控制缓冲液的pH值，提高提取效率；使用PEG降低DNA剪切力损伤，保证DNA的完整性；从而使得血浆游离DNA的提取无抑制剂残留、提取质量高、操作简便、成本低廉。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种氨基酸缓冲液，包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M氯化钠，40-100mMTris-HCl，20-50mMEDTA。前述的一种氨基酸缓冲液，氨基酸缓冲液的pH范围为：2.1-2.4。前述的一种氨基酸缓冲液，氨基酸包括：精氨酸，甘氨酸，组氨酸，谷氨酰胺。前述的一种氨基酸缓冲液，离液盐包括：碘化钠，盐酸胍，硫氰酸胍。前述的一种氨基酸缓冲液，PEG包括：PEG200，PEG400，PEG600。一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括如下试剂：裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附缓冲液，洗涤液，TE洗脱液；氨基酸吸附缓冲液包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M氯化钠，40-100mMTris-HCl，20-50mMEDTA，pH2.1-2.4。前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，裂解液包括：20-100mMTris-HCl，50-150mMNaCl，5-10％甘油，1-10％SDS，1-2mMEDTA，pH7.0-8.0。前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，蛋白酶K工作液包括：取20mg蛋白酶K溶于1ml蛋白酶K缓冲液中，得到工作液，浓度20mg/ml；蛋白酶K缓冲液：0.2-2％SDS，pH7.5-8.0。前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，洗涤液包括：Tris-HCl50-100mM，乙醇65-80％，pH2.1-2.4。前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，TE洗脱液包括：1-2mMEDTA，10-25mMTris-HCl，调节至pH8.5-10.0。本专利技术的有益之处在于：本专利技术的缓冲液结合低浓度离液盐和氨基酸，使得cfDNA的回收率提高到45％，高于市场现有cfDNA提取试剂盒；本专利技术通过控制提取试剂的pH值低于二氧化硅的零电荷点，使硅胶膜表面带大量正电荷，同时扩大了DNA吸附面积，极大程度上促进了小片段DNA的捕获效率，同时使用极低的10μl洗脱体积，提高了cfDNA的产量和浓度；探究发现PEG有明显防止DNA受剪切力损伤的作用，在离心柱法中添加PEG可以极大程度上保证DNA的完整性，提高cfDNA质量；本专利技术的提取方法可以替代高浓度离液盐条件并可以高效地促进硅胶膜对小片段DNA的捕获能力，增大cfDNA提取效率，同时保证DNA的完整性，无抑制剂残留、提取的cfDNA质量高、操作简便、成本低廉。附图说明图1是本专利技术实验三使用PEG600对降低cfDNA受剪切力损伤影响的对比结果(虚线代表不加PEG600组，实线代表添加10％的PEG600组)；图2是本专利技术实验四试剂盒与Qiagen公司试剂盒提取的cfDNA实时荧光定量PCR检测图(实线为本专利技术试剂所提取的结果，虚线为Qiagen试剂盒所提取的结果)。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一种氨基酸缓冲液，包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M氯化钠，40-100mMTris-HCl，20-50mMEDTA，pH：2.1-2.4。一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括如下试剂：裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附缓冲液，洗涤液，TE洗脱液；裂解液包括：20-100mMTris-HCl，50-150mMNaCl，5-10％甘油，1-10％SDS，1-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨基酸缓冲液，其特征在于，包括：80‑200mM氨基酸，0.1‑0.3M离液盐，5％‑15％PEG，0.5‑1.2M氯化钠，40‑100mM Tris‑HCl，20‑50mM EDTA。

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸缓冲液，其特征在于，包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M氯化钠，40-100mMTris-HCl，20-50mMEDTA。2.根据权利要求1所述的一种氨基酸缓冲液，其特征在于，氨基酸缓冲液的pH范围为：2.1-2.4。3.根据权利要求1所述的一种氨基酸缓冲液，其特征在于，所述氨基酸包括：精氨酸，甘氨酸，组氨酸，谷氨酰胺。4.根据权利要求1所述的一种氨基酸缓冲液，其特征在于，所述离液盐包括：碘化钠，盐酸胍，硫氰酸胍。5.根据权利要求1所述的一种氨基酸缓冲液，其特征在于，PEG包括：PEG200，PEG400，PEG600。6.一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附缓冲液，洗涤液，TE洗脱液；所述氨基酸吸附缓冲液包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M氯化钠，40...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨芳梅，张惠贤，卢德景，徐红梅，
申请(专利权)人：合肥欧创基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34