一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法技术

本发明专利技术提供一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，通过蛋白裂解，过柱结合，清洗和洗脱等步骤实现。本发明专利技术方法可使用常规的蛋白裂解配方和常规的核酸过柱结合纯化方法，只需加入关键的离心去液步骤，无需使用大体积结合液，无需使用磁珠，操作简单，不需要额外的技巧，试剂成本低，与一般组织细胞核酸提取试剂盒相比，可将核酸捕获率提高至3‑8倍。核酸提取所得与专用血浆血清游离核酸提取试剂盒相似，是一种经济又有效的方法。

A Method to Improve the Capture Rate of Trace Nucleic Acids in Acellular Body Fluid

【技术实现步骤摘要】
一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，用于提高从无细胞体液中富集和纯化核酸时的核酸捕获率，特别适用于从血清或血浆中富集和纯化微量DNA的场合。
技术介绍
液体活检是当前生物医学领域研究的热点。液体活检主要是指从活体的血清、血浆、脑脊液等无细胞体液中提取微量核酸物质，进一步检测用于提示疾病。微量核酸物质主要指DNA，但也包括各类RNA。从无细胞血清和血浆所提取的核酸物质主要为死亡细胞所释放，在体内血液系统中循环，可称为游离核酸，其主要成份被称为游离DNA。游离DNA具有凋亡细胞所释放DNA的特征，表现为所提取纯化的DNA电泳时在约170bp及其整数倍长度的位置有产物条带，而较少1000bp以上的大片段。因此，无细胞血清或血浆中提取DNA相比于细胞提取的基因组DNA有显著的不同。当身体存在疾病，疾病导致的细胞死亡可释放核酸物质，此时游离核酸携带了疾病的信息。液体活检的含义正是通过对以无细胞血清和血浆为主要目标的体液中提取纯化的核酸物质进行检测，从而达到辅助诊断疾病的目的，并有可能将来在某些疾病中作为诊断标准。无细胞血清或血浆中的核酸物质是极微量的。血清或血浆作为核酸提取纯化对象，其初始所需处理的体积远较提取组织时为大，同时血清血浆中可能还存在未明确的影响核酸吸附捕获的成份，这极大的影响了核酸的提取效率。一般用于组织细胞核酸提取的试剂盒几乎无法获得有效提取。目前有少数专用商业化试剂盒可提供较为高效的提取，其中以德国QIAGEN公司的QIAampCirculatingNucleicAcid系列试剂盒效果为优。QIAGEN公司试剂盒主要为过柱纯化型，该试剂盒采用大体积过柱结合液去稀释大体积血清或血浆对提取效率的影响，可成功捕获到微量核酸，但成本较高(目前售价50次提取需近1万元人民币)。另一种磁珠吸附法有较多公司提供产品，但磁珠法在大体积液体中对微量核酸的吸附捕获率无法令人满意，特别在游离核酸量较少时。与过柱法比较，磁珠法核酸捕获率偏低，在清洗磁珠时不可避免的会损失核酸物质。此外，磁珠法对磁珠颗粒直径、悬浮分散度、均一性等要求高，试剂盒成本仍然较高。磁珠法提取对操作者的操作手法要求也较高，提取效果也不够稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，包括蛋白裂解，过柱结合，清洗和洗脱等步骤，其中关键是在蛋白裂解和过柱结合之间加入以下步骤：(1)向盛有已裂解蛋白体液的离心管中加入0.5-3倍体积的低介电常数溶剂，混匀；(2)在常温下中高速离心；(3)用直接倾倒液体，或者吸除液体，或者倾倒后再加以离心再吸除的方法去除液体成份；(4)用核酸过柱结合液复溶贴壁核酸。具体通过以下步骤实现：(1)将无细胞体液加入高分子化合物材质的塑料离心管中，再加入常用的蛋白酶K和蛋白变性剂为主要成份的蛋白裂解液，在蛋白酶K适宜工作温度下孵育，使液体中蛋白大分子裂解，目的使后续高速离心时不出现大量蛋白沉淀，而液体中的微量核酸在蛋白酶K去除核酸酶功能的保护下得以完整保存。无细胞体液，包含人体和动物的体液，包含血浆、血清、羊水、脑脊液、胸水、腹水、心包积液、窦腔积液、滑囊积液、乳腺管液体和眼房水。所使用的离心管为高分子化合物材质，包含以聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯为主要材质的塑料离心管。优选为聚丙烯材质。包含尖底、圆底、方底的圆柱形塑料离心管。本专利技术所述蛋白裂解液配方必须包含蛋白酶K和蛋白变性剂两种关键成份，此为公知常用配方，其溶液PH值在7.5-8之间为最佳，但PH值在7-9之间也可发挥蛋白裂解作用。本专利技术所述蛋白裂解液还可包含Tris，EDTA等其他具有金属离子螯合作用、pH值缓冲作用的常规成份，主要用于调节PH值及螯合金属离子，均为常规方法。所述蛋白裂解液中蛋白酶K用量根据所需处理的血清或血浆量和其蛋白含量不同可有不同，蛋白酶K加入量可以过量，但不可以不足。在血清(血浆)与蛋白裂解液组成的混合液中，蛋白酶K含量为2ug/微升时，可满足一般蛋白含量的血浆或血清蛋白裂解要求，对于绝大部分血浆或血清已足够。蛋白变性剂包括质量百分比为0.2-20％的十二烷基硫酸钠，0.5-8mol/L的乙酸，0.9-8mmol/L的盐酸胍，0.9-8mmol/L的硫氰酸胍，4-8mmol/L的尿素，以及上述蛋白变性剂不析出沉淀的混合液。以上蛋白变性剂均为公知常用配方。本专利技术所述蛋白裂解孵育的温度和时间根据所处理样品量的多少可有不同。蛋白酶K在30℃和80℃之间均有一定的活性，但以35℃-60℃之间活性相对较高，优选的以55℃孵育为佳。当所处理样品量较少(如<100微升)时，35℃或者80℃孵育均可达到裂解蛋白的作用，且孵育时间10分钟即可。当处理样品量较大时(如>100微升)时，优选的以50-60℃之间孵育，孵育时间应大于1小时，优选的为3小时，过夜孵育亦可，但不应超过16小时。(2)过柱结合：蛋白裂解完成后，向离心管中加入原有液体体积0.5倍至3倍体积的低介电常数溶剂，在离心管与离心轴形成倾角的状态下，于不低于4℃且不大于35℃的环境温度下，中速或高速离心使液体中微量核酸牢固贴附于塑料离心管管壁。离心后直接开盖倒除液体，留有残液者再次离心并用移液器吸除液体的方法将离心管中液体成份去除，目的为使离心管中液体尽量去除。低介电常数溶剂是指在20℃时介电常数小于纯水的溶剂，包含乙醇、异丙醇、乙酸、丙酮、正己醇和四氯化碳。优选的为乙醇或异丙醇。本专利技术所述在蛋白裂解完成后，向裂解液中加入低介电常数的溶剂。所述用于添加的低介电常数溶剂应为纯品，即含量应>99％。所添加量根据溶剂的介电常数与水的介电常数的相对大小差异而不同，水在20℃时介电常数为78，乙醇为24，此时乙醇在最终离心溶液中的质量含量应大于60％，加入量一般为原溶液体积的2倍。异丙醇在20℃时介电常数为18，异丙醇在最终离心溶液中的质量含量应大于33％，异丙醇加入量一般为原溶液体积的1倍。丙酮、正己醇、乙酸和四氯化碳在20℃时介电常数分别为21，13，6和2，其加入量为一般不小于原溶液体积的1.5倍，0.75倍，0.5倍和0.5倍即可发挥作用。本专利技术所述的裂解体系液体中加入低介电常数溶剂后在常温下离心，包含离心时离心管的环境温度为常温，温度介于4℃和35℃之间，优选的为4℃或20℃。中速或高速离心。中速或高速离心是指离心力于1000克-30000克，均有使核酸贴壁粘附的作用。优选离心力为8000克，离心力离心40分钟。离心力越小，使核酸牢固贴附所需的时间越长，对于2ml离心管30度倾斜时，当1000克离心力时离心2小时方可牢固贴壁，当4000克离心力离心时50分钟可牢固贴壁，当30000克离心力时只需离心10分钟即可牢固贴壁。离心时离心管的位置应使离心管长径方向与离心轴方向形成离心倾角，离心倾角可在20-70度之间，优选的为30-40度角状态，目的为减少溶液中核酸贴附于离心管壁所需行进的距离，使核酸更快贴附于离心管壁。同时，核酸贴附于离心管壁的一侧，也有利于后续在另一侧倾倒或吸除液体。通过直接倾倒，或吸除，或倾倒加吸除的方法将离心管内液体去除，残留液体总量不能超本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，包括蛋白裂解，过柱结合，清洗和洗脱等步骤，其特征在于，在蛋白裂解和过柱结合之间加入以下步骤：(1)向盛有已裂解蛋白体液的离心管中加入0.5‑3倍体积的低介电常数溶剂，混匀；(2)在常温下中高速离心；(3)用直接倾倒液体，或者吸除液体，或者倾倒后再加以离心再吸除的方法去除液体成份；(4)用核酸过柱结合液复溶贴壁核酸。

【技术特征摘要】
1.一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，包括蛋白裂解，过柱结合，清洗和洗脱等步骤，其特征在于，在蛋白裂解和过柱结合之间加入以下步骤：(1)向盛有已裂解蛋白体液的离心管中加入0.5-3倍体积的低介电常数溶剂，混匀；(2)在常温下中高速离心；(3)用直接倾倒液体，或者吸除液体，或者倾倒后再加以离心再吸除的方法去除液体成份；(4)用核酸过柱结合液复溶贴壁核酸。2.根据权利要求1所述的一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)蛋白裂解：将无细胞体液加入离心管中，再加入蛋白裂解液孵育；(2)蛋白裂解完成后，向离心管中加入原有液体体积0.5倍至3倍体积的低介电常数溶剂，在离心管与离心轴形成倾角的状态下，于不低于4℃且不大于35℃的环境温度下，中高速离心使液体中微量核酸牢固贴附于塑料离心管管壁，离心后直接开盖倒除或吸除液体，留有残液者再次离心并用移液器吸除液体的方法将离心管中液体成份去除，目的为使离心管中液体尽量去除；(3)向离心管中加入常规过柱结合液，涡旋振荡充分混匀，涡旋振荡时，离心管内液体快速旋转，其贴壁液面升高，使离心管正立和倒置交叉涡旋振荡的方法使旋转液体触及离心管管壁有可能吸附核酸的所有位置，涡旋振荡使贴壁核酸重新溶解于过柱结合液中，后续按常规方法过核酸纯化柱，将液体中核酸吸附于纯化柱的硅化吸附膜，加入清洗液离心后，再用常规洗脱液将核酸洗脱，即可获得纯化的无细胞含蛋白液体中核酸物质。3.根据权利要求2所述的一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白裂解液的PH值在7.5-8之间。4.根据权利要求2所述的一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白裂解孵育的温度在30℃和80℃之间，但以35℃-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄彦钦，宋永茂，袁瑛，郑树，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33