一种内源性酶触发的DNA步行器及其检测UDG的应用制造技术

本公开提供了一种内源性酶触发的DNA步行器及其检测UDG的应用，DNA步行器包括金纳米颗粒、至少一条行走链和若干轨道链，所述行走链和轨道链均为单链DNA，行走链的一端与金纳米颗粒连接，每条轨道链的一端均与金纳米颗粒连接，每条轨道链的另一端均连接荧光团，行走链含有第一序列，轨道链的含有第二序列，第一序列与第二序列互补，第二序列中的一个碱基为尿嘧啶碱基。本公开构建的DNA步行器能对细胞内的UDG活性进行灵敏成像。

An Endogenous Enzyme-triggered DNA Walker and Its Application in UDG Detection

【技术实现步骤摘要】
一种内源性酶触发的DNA步行器及其检测UDG的应用
本公开涉及一种内源性酶触发的DNA步行器及其检测UDG的应用。
技术介绍
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是一种DNA损伤修复蛋白，其主要功能是通过催化尿嘧啶和脱氧核糖之间的N-糖苷键水解来去除尿嘧啶。UDG的功能是尿嘧啶碱基切除修复(UBER)的第一步，然后是脱嘌呤/脱嘧啶(AP)内切核酸酶，连接酶和聚合酶作用以完成UBER途径，维持基因组的完整性。然而，细胞内UDG活性异常会导致DNA复制过程中错误引入尿嘧啶，导致不正确的碱基配对和基因突变，最终增加疾病的发生率，例如免疫缺陷症、布鲁姆综合征和淋巴瘤。细胞内UDG活性检测对于深入理解DNA修复系统和进一步研究突变相关的疾病至关重要。DNA探针被细胞内核酸酶降解导致高背景并干扰检测灵敏度，从而使得UDG的检测较为困难。DNA分子机器是由合成寡核苷酸组成的特殊设计的组件，它们改变状态并进行机器式运动以响应外部刺激。它类似于天然生物分子机器，例如通过一系列能量转换步骤和合作行为参与生命系统中重要过程的运动蛋白。与蛋白质相比，DNA的独特性质，包括碱基配对的高保真性，结构和相互作用的简单性，使其成为构建可控分子机器的有前途的材料。已经报道了各种DNA分子机器，包括步行器、镊子、齿轮、旋转器、节拍器和转运器，它们开始在传感，程序合成和器件制造中显示出有吸引力的应用。DNA步行器是一类独特的DNA分子机器，可使特殊组分寡核苷酸沿着预先设计的轨道逐步移动。DNA步行器的特点是它可以在特殊刺激的驱动下自主且连续地行走多步。它可以是固有信号放大器，因为重复步骤可以引起反应循环以产生累积信号。大多数DNA步行器通过体外刺激在胞外运行。据本公开专利技术人所知，最近，研究人员开始探索在活细胞中运行的DNA步行器，其行为与天然生物分子机器类似。然而，经本公开专利技术人研究发现，为了维持胞内DNA步行器的运行，须引入外源金属离子(Mn2+，Zn2+)或燃料寡核苷酸，这会导致细胞状态的改变或完整燃料DNA的降解，最终限制细胞中DNA步行器的运行，由于DNA链对非特异性核酸酶降解的抵抗和步行器独特的扩增能力和纳米颗粒3-D表面上强大的DNA富集能力，DNA步行器在活细胞中运行成像UDG活性，而UDG活性的成像之前存在未受保护的DNA探针以及细胞内扩增的困难引起的灵敏度有限的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种内源性酶触发的DNA步行器及其检测UDG的应用，该DNA步行器对UDG的检测有良好的特异性及灵敏度。为了实现上述目的，本公开的技术方案为：一方面，一种内源性酶触发的DNA步行器，包括金纳米颗粒、至少一条行走链和若干轨道链，所述行走链和轨道链均为单链DNA，行走链的一端与金纳米颗粒连接，每条轨道链的一端均与金纳米颗粒连接，每条轨道链的另一端均连接荧光团，行走链含有第一序列，轨道链的含有第二序列，第一序列与第二序列互补，第二序列中的一个碱基为尿嘧啶碱基。本公开将DNA步行器构建在金纳米颗粒(AuNP)表面上，由行走链和数倍的荧光团标记的含尿嘧啶的轨道链构成。荧光素的荧光被金纳米粒子的表面等离子体吸收并淬灭。行走链与轨道链部分互补并可杂交。通过纳米颗粒辅助的内吞作用，DNA步行器，包括其所有成分，可以很容易地进入活细胞。此外，纳米颗粒表面固定的DNA可以被保护免受核酸酶降解，以保持DNA步行器的完整性并在胞内运行。在内源性UDG的作用下，去除了轨道链中的尿嘧啶碱基，留下了AP位点。随后，在内源性脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)的作用下AP位点被切割，荧光素被释放并恢复荧光。然后，行走链继续与下一个轨道链杂交并启动下一个轨道链解离和荧光素释放循环，沿着三维(3-D)表面移动直到所有轨道链被消耗。另一方面，一种上述DNA步行器在检测UDG中的应用。第三方面，一种检测UDG的生物传感器，包括上述DNA步行器和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶。第四方面，一种检测UDG的检测试剂盒，包括上述DNA步行器、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、1×NEBCutsmart缓冲液和PBS缓冲液。第五方面，一种检测UDG的方法，采用上述DNA步行器、生物传感器或检测试剂盒，将DNA步行器加入待测溶液中进行孵育，再添加脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶进行反应，然后进行荧光检测。本公开的有益效果为：本公开的内源酶驱动的DNA步行器可用于在活细胞中成像UDG活性，在UDG和APE1的作用下，杂交的含尿嘧啶的轨道链被去除碱基并切割，使得行走链的连续解离/杂交并沿着3-D轨道运动。携带荧光团的被切割的大量轨道链片段被释放以恢复荧光和放大信号输出。DNA步行器具有明确定义的轨道，显示了对靶酶的良好特异性，具有对非特异性核酸酶降解的抗性，从而提高检测UDG的灵敏度。并且本公开的DNA步行器可以在活细胞中独立运行。附图说明构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。图1为本公开的原理图；图2为本公开实施例制备的纳米金颗粒的结构表征图，A为紫外-可见吸收光谱，B为透射电子显微镜照片；图3为本公开实施例中荧光强度与已知金纳米粒子表面已知浓度轨道链之间的校正曲线，插图为DTT孵育的DNA步行器上清液的荧光光谱；图4为本公开实施例中DNA步行器和其DNA-AuNP类似物(将U碱基替换为T碱基)在1U/mLUDG和30U/mLAPE1存在时荧光强度随时间的变化曲线；图5为本公开实施例中行走链和轨道链间互补碱基数目的优化表征柱状图，Fwalker和Fcontrol分别代表DNA步行器和其DNA-AuNP类似物(将U碱基替换为T碱基)在1U/mLUDG和30U/mLAPE1作用下所产生的荧光强度；图6为本公开实施例DNA步行器的表征图，A为DNA步行器和其DNA-AuNP类似物在UDG和APE1存在时的荧光光谱，B为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图，泳道M为DNAmarker，泳道1为巯基化的轨道链，泳道2为巯基化的行走链，泳道3为DNA步行器运行结束后取代下的寡聚核酸链，泳道4为DNA-AuNP对照物运行后取代下的寡聚核酸链；图7为本公开实施例DNA步行器荧光增加的原理表征图，A为在1U/mLUDG和30U/mLAPE1作用下DNA步行器与轨道链修饰金纳米对照物的荧光光谱，B为DNA步行器与含有行走链修饰金纳米对照物/轨道链修饰金纳米对照物的混合物的荧光光谱，a为DNAwalker，b为Walkingstrand-AuNP+trackstrand-AuNP；图8为本公开实施例DNA步行器的特异性表征图，hAAG、hOGG1、endoIV和UDG的浓度均为1U/mL；图9为本公开实施例中UGI对DNA步行器运行的抑制作用的表征曲线；图10为本公开实施例DNA步行器在UDG和APE1、DNaseI和缓冲液作用下荧光强度随时间的变化曲线；图11为本公开实施例使用DNA步行器(上面一行)和其DNA-AuNP类似物(下面一行)荧光成像HeLa细胞中UDG酶活性的结果表征图；图12为本公开实施例对DNA步行器和其DNA-AuNP类似本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内源性酶触发的DNA步行器，其特征是，包括金纳米颗粒、至少一条行走链和若干轨道链，所述行走链和轨道链均为单链DNA，行走链的一端与金纳米颗粒连接，每条轨道链的一端均与金纳米颗粒连接，每条轨道链的另一端均连接荧光团，行走链含有第一序列，轨道链的含有第二序列，第一序列与第二序列互补，第二序列中的一个碱基为尿嘧啶碱基。

【技术特征摘要】
1.一种内源性酶触发的DNA步行器，其特征是，包括金纳米颗粒、至少一条行走链和若干轨道链，所述行走链和轨道链均为单链DNA，行走链的一端与金纳米颗粒连接，每条轨道链的一端均与金纳米颗粒连接，每条轨道链的另一端均连接荧光团，行走链含有第一序列，轨道链的含有第二序列，第一序列与第二序列互补，第二序列中的一个碱基为尿嘧啶碱基。2.如权利要求1所述的DNA步行器，其特征是，第一序列的碱基个数为数目为8个。3.如权利要求1所述的DNA步行器，其特征是，行走链和轨道链均通过Au-S键与金纳米颗粒连接。4.如权利要求1所述的DNA步行器，其特征是，所述金纳米颗粒的粒径为12～14nm；或，行走链和轨道链的摩尔比为1:15～25。5.如权利要求1所述的DNA步行器，其特征是，行走链从5’端至3’端的序列为：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTAAGC，轨道链从5...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，徐晓文，张苹苹，张芮源，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37