一种ARMS-TaqManBlocker体系的Blocker设计和筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种ARMS

【技术实现步骤摘要】
一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计和筛选方法


[0001]本专利技术涉及肿瘤突变检测
，具体是一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计和筛选方法。

技术介绍

[0002]近年来，探针的非放射性标记受到广泛重视，同时得到迅速发展，广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。ARMS技术是常用的荧光探针法，其基本原理是，如果引物的3
’
端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3
’
端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。有时候为了提高特异性，会在体系中加入野生型模板扩增阻断剂(Blocker)，用以压制野生型模板的扩增，虽然这种方法在一定程度上可以压制野生，但是由于缺乏准确的Blocker设计软件和有效的筛选规则，导致压制效果不理想；另外，也可在ARMS引物的3
’
端倒数第二或第三个碱基处引入错配碱基，但是引入错配碱基通常会牺牲灵敏度。因此，常规ARMS-TaqMan Blocker体系一般很难同时做到灵敏度、特异性兼顾，常需要复杂繁琐的优化工作。
[0003]传统的竞争性Blocker设计原则为：
①
将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点，与ARMS引物部分重叠，起到位置竞争作用，且尽量使突变位点位于Blocker的中间位置，使得Blocker熔点差较大(依据：突变位点位于中间时的熔点差大于突变位点位于两边时的熔点差)；
②
Blocker与野生型模板完全匹配，Tm值比ARMS引物与野生型模板匹配的Tm值高约5℃，使Blocker与野生型模板优先结合，而且有时为了增大熔点差，会加入LNA、MGB等修饰；
③
Blocker与突变型模板不完全匹配，Tm值比ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值低，使ARMS引物与突变型模板优先结合；
④
Blocker的3
’
末端需加上封闭修饰，如硫代修饰、氨基修饰、磷酸化修饰等，以防止延伸。
[0004]传统Blocker设计一般是利用Tm值预测软件进行Tm值预测，不同的预测软件预测出的Tm值悬殊很大，同时PCR组分也会对Tm值产生一定的影响，因而无法准确评估Blocker的实际Tm值，导致Blocker的压制效果不好。按照一般设计原则设计得到的Blocker并不符合最优条件，表现在Blocker与突变型模板不完全匹配，Tm值均比ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值低，且软件预测的Tm值也仅供参考，实际Tm值可能与预测接近，也可能相差很大，所以通常设计多条Blocker进行筛选，但同时满足
②③
条件的Blocker本身就很少，且鉴于修饰成本高，一般情况下仅设计1-3条供筛选。如果通过软件进行Tm值预测，很可能所有Blocker的低熔点均比ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值低，能找到最优Blocker的几率极小，只有当设计的Blocker里面恰巧有一条Blocker的低熔点实际上与ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值一致或极为接近，才可以起到良好的压制效果。

技术实现思路

[0005]针对现有ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计存在的技术缺陷，本专利技术提供
一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计和筛选方法。
[0006]本专利技术保护一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计方法，将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点即可；Blocker与野生型模板完全匹配，完全匹配的Tm值高于ARMS引物与野生型模板匹配的Tm值，允许熔点差低于5℃；Blocker与突变型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值与ARMS引物跟突变型模板的Tm值一致或接近；Blocker的3
’
末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。
[0007]本专利技术的Blocker设计原则，不严格要求突变位点位于Blocker的中间位置，也不需要满足熔点差5℃的要求，只要存在熔点差即可，相对来说更容易设计。与此同时，由于没有严格要求5℃左右的熔点差，所以不需要引入LNA修饰，不存在LNA合成难度及额外的成本费用。
[0008]本专利技术的Blocker设计原则，保证Blocker与突变型模板不完全匹配的Tm值与ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值一致或接近，因为只有在这个Tm值下，体系中的Blocker才能不会产生冗余，起到最大的压制效果。这一点与传统的竞争性Blocker设计原则是完全不同的。
[0009]本专利技术的Blocker设计原则，Blocker的3
’
末端不需要加特殊的封闭修饰，而是通过在3
’
末端添加个别无关碱基，这些无关碱基与模板不匹配，从而无法在Taq DNA聚合酶作用下发生延伸，因此不必加特殊修饰，节约了近几十倍的成本。
[0010]本专利技术还保护一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker筛选方法，按照上述Blocker设计原则设计3-10条Blocker，这些Blocker的低熔点都在ARMS引物跟突变型模板匹配的Tm值附近，有比之高的，也有比之低的，不同Blocker之间可以相差1碱基，使这些Blocker与突变型模板匹配的Tm值在ARMS引物跟突变型模板匹配的Tm值附近呈现逐步升高的梯度，这样Tm值范围广而密，不会错失最佳Blocker；然后经实时PCR验证梯度Blocker对体系的灵敏度和特异性的影响，筛选出对灵敏度无影响且特异性最好的Blocker。
[0011]传统的Blocker设计原则设计成本高，对于多位点检测体系来说，成本费用更是不可低估。本专利技术的Blocker设计和筛选原则，具有明确的筛选方向，一次性就能筛出最佳Blocker，不需要反复修改，而且Blocker与普通引物一样合成，不需要特殊修饰和纯化，成本低廉。
[0012]本专利技术还保护上述ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker筛选方法在肿瘤突变检测中的应用。
附图说明
[0013]图1为针对E545K位点按照本专利技术设计原则设计的Blocker梯度筛选及传统设计原则设计的Blocker比较；
[0014]图2为针对braf位点按照本专利技术设计原则设计的Blocker梯度筛选及传统设计原则设计的Blocker比较；
[0015]图3为针对G719位点按照本专利技术设计原则设计的Blocker梯度筛选及传统设计原则设计的Blocker比较。
具体实施方式
[0016]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。本专利技术的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本专利技术限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计方法，其特征在于，将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点即可；Blocker与野生型模板完全匹配，完全匹配的Tm值高于ARMS引物与野生型模板匹配的Tm值，允许熔点差低于5℃；Blocker与突变型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值与ARMS引物跟突变型模板的Tm值一致或接近；Blocker的3
’
末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。2.一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker筛选方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨芳梅，徐红梅，
申请(专利权)人：合肥欧创基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：