用于定相测序的方法和组合物技术

本公开内容提供了用于对核酸分子的复杂群体进行分子标记的方法和组合物。本公开内容提供了从高通量核酸测序数据获得标记的核酸分子的相位信息的方法和组合物。

Methods and Compounds for Phase Sequencing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于定相测序的方法和组合物交叉引用本申请要求于2016年8月30日提交的美国临时申请62/381,547的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
技术介绍
下一代测序(NGS)技术可以允许对来自不同来源的大量核酸分子进行同时的高通量测序。然而，测序读取长度的限制可能使得难以确定在测序反应中可读取的遗传变异是源自相同的核酸分子还是源自不同的核酸分子。援引并入本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。如果通过引用而并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾，则本说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
技术实现思路
在一些方面，本公开内容提供了一种方法，其包括：a)提供包含多个核酸的样品，其中所述多个核酸包含核酸链，其中所述核酸链包含含有延长序列和分子条形码的衔接子，其中所述延长序列与所述核酸链中的核酸序列的至少一部分互补；b)使所述延长序列与所述核酸链中的所述核酸序列的所述部分退火，从而生成部分双链体核酸链，其中所述部分双链体核酸链包含含有单链区的5’部分和含有与所述核酸序列的所述部分形成分子内双链体的所述延长序列的3’部分；以及c)使用所述部分双链体核酸链的所述5’部分作为模板，用聚合酶延伸所述延长序列，从而生成延伸的核酸。在一些实施方案中，所述核酸链在单链核酸中。在一些实施方案中，所述核酸链在双链核酸中。在一些实施方案中，所述核酸链的3’端包含所述衔接子。在一些实施方案中，所述衔接子的3’端包含所述延长序列。在一些实施方案中，所述延伸的核酸包含含有杂交区和非杂交区的茎环结构。在一些实施方案中，所述杂交区包含第一链和第二链，其中所述第一链包含所述延伸的核酸的5’端，并且所述第二链包含所述延伸的核酸的3’端。在一些实施方案中，所述第二链的5’端包含所述延长序列。在一些实施方案中，所述非杂交区在所述第一链的3’侧。在一些实施方案中，所述非杂交区的3’端包含所述分子条形码。在一些实施方案中，所述核酸链包含DNA。在一些实施方案中，所述核酸链包含cDNA。在一些实施方案中，所述核酸链包含基因组DNA。在一些实施方案中，包含所述衔接子的所述核酸链由基因组DNA生成。在一些实施方案中，包含所述衔接子的所述核酸链由无细胞核酸生成。在一些实施方案中，包含所述衔接子的所述核酸链由来自细胞的核酸生成。在一些实施方案中，包含所述衔接子的所述核酸链由来自生物样品的核酸生成。在一些实施方案中，包含所述衔接子的所述核酸链由来自无细胞样品的核酸生成。在一些实施方案中，所述核酸链由RNA生成。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤a)之前逆转录所述RNA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述衔接子附加到核酸分子上，以生成包含所述衔接子的所述核酸链。在一些实施方案中，所述附加通过连接进行。在一些实施方案中，所述附加通过聚合酶链反应(PCR)进行。在一些实施方案中，所述PCR用包含与所述第一衔接子互补的序列的寡核苷酸进行。在一些实施方案中，所述寡核苷酸进一步包含与模板核酸的至少一部分互补的序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的3’端包含与所述模板核酸的所述至少一部分互补的所述序列。在一些实施方案中，与所述模板核酸的所述至少一部分互补的所述序列包含随机序列。在一些实施方案中，与所述模板核酸的所述至少一部分互补的所述序列包含与所述模板核酸的所述部分的完全互补性。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述附加后纯化包含所述第一衔接子的所述核酸链。在一些实施方案中，所述纯化包括在步骤a之前去除一个或多个未附加的衔接子。在一些实施方案中，所述纯化包括酶消化所述一个或多个未附加的衔接子。在一些实施方案中，所述酶消化包括使用外切核酸酶。在一些实施方案中，所述一个或多个未附加的衔接子包含尿嘧啶，其中所述去除所述一个或多个未附加的衔接子包括使用尿嘧啶-DNA糖基化酶、内切核酸酶或两者。在一些实施方案中，所述纯化包括使用固相可逆固定来去除所述一个或多个未附加的衔接子。在一些实施方案中，所述纯化包括使用基于柱的固相提取来去除所述一个或多个未附加的衔接子。在一些实施方案中，所述纯化包括使用凝胶过滤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤a)之前对包含所述衔接子的所述核酸链进行扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤a)之前使包含所述第一衔接子的双链DNA分子变性，从而生成包含含有所述第一衔接子的所述核酸链的单链核酸。在一些实施方案中，所述变性包括使用酶来降解所述双链DNA分子的链。在一些实施方案中，所述酶是外切核酸酶。在一些实施方案中，所述外切核酸酶是λ外切核酸酶。在一些实施方案中，所述变性包括：对所述双链DNA分子的链进行生物素化，以生成生物素化的双链DNA分子；使所述生物素化的双链DNA分子与链霉亲和素包被的表面结合；以及洗涤所述表面以释放非生物素化的DNA链，从而使所述双链DNA分子变性。在一些实施方案中，所述变性包括加热所述双链DNA分子。在一些实施方案中，所述变性包括碱变性。在一些实施方案中，所述延长序列包含随机序列。在一些实施方案中，所述延长序列与所述核酸序列的所述部分基本上或完全互补。在一些实施方案中，所述分子条形码包含随机或半随机序列。在一些实施方案中，所述样品中的所述多个核酸包含含有独特分子条形码的第一衔接子。在一些实施方案中，所述多个核酸中的所述第一衔接子进一步包含所述多个单链核酸中的每一个所共有的第二条形码。在一些实施方案中，通过所述延伸的核酸中的所述延伸生成的3’延伸部分包含约100个碱基至约400个碱基的长度。在一些实施方案中，通过所述延伸的核酸中的所述延伸生成的3’延伸部分包含约400个碱基至约500个碱基的长度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将另外的衔接子附加到所述延伸的核酸上。在一些实施方案中，所述附加通过连接进行。在一些实施方案中，所述附加通过聚合酶链反应进行。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应包括使用一个或多个寡核苷酸，所述一个或多个寡核苷酸包含含有所述另外的衔接子的5’部分和含有与通过所述延伸的核酸中的所述延伸生成的3’延伸部分互补的序列的3’部分。在一些实施方案中，所述另外的衔接子附加在所述延伸的核酸的3’端。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对附加到所述另外的衔接子上的所述延伸的核酸进行扩增。在一些实施方案中，所述扩增用第一引物和第二引物进行，其中所述第一引物与所述第一衔接子或其互补体退火，并且其中所述第二引物与所述第二衔接子或其互补体退火。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述扩增的产物进行测序以生成测序读取。在一些实施方案中，所述测序包括大规模平行测序。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述测序读取进行定相，以确定所述多个核酸中两个或更多个感兴趣的核酸序列的分子起源。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使挂锁探针(padlockprobe)与所述延伸的核酸退火，其中所述挂锁探针包含通过连接体序列连接的5’端和3’端。在一些实施方案中，所述方法进一步包括延伸所述挂锁探针的所述3’端，以生成包含所述挂锁探针和与所述核酸序列的所述部分互补的序列的延伸核酸。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，其包括：a)提供包含多个核酸的样品，其中所述多个核酸包含核酸链，其中所述核酸链包含含有延长序列和分子条形码的衔接子，其中所述延长序列与所述核酸链中的核酸序列的至少一部分互补；b)使所述延长序列与所述核酸链中的所述核酸序列的所述部分退火，从而生成部分双链体核酸链，其中所述部分双链体核酸链包含含有单链区的5’部分和含有与所述核酸序列的所述部分形成分子内双链体的所述延长序列的3’部分；以及c)使用所述部分双链体核酸链的所述5’部分作为模板，用聚合酶延伸所述延长序列，从而生成延伸的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.30 US 62/381,5471.一种方法，其包括：a)提供包含多个核酸的样品，其中所述多个核酸包含核酸链，其中所述核酸链包含含有延长序列和分子条形码的衔接子，其中所述延长序列与所述核酸链中的核酸序列的至少一部分互补；b)使所述延长序列与所述核酸链中的所述核酸序列的所述部分退火，从而生成部分双链体核酸链，其中所述部分双链体核酸链包含含有单链区的5’部分和含有与所述核酸序列的所述部分形成分子内双链体的所述延长序列的3’部分；以及c)使用所述部分双链体核酸链的所述5’部分作为模板，用聚合酶延伸所述延长序列，从而生成延伸的核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链在单链核酸中。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链在双链核酸中。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链的3’端包含所述衔接子。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子的3’端包含所述延长序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸的核酸包含含有杂交区和非杂交区的茎环结构。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述杂交区包含第一链和第二链，其中所述第一链包含所述延伸的核酸的5’端，并且所述第二链包含所述延伸的核酸的3’端。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二链的5’端包含所述延长序列。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述非杂交区在所述第一链的3’侧。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述非杂交区的3’端包含所述分子条形码。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链包含DNA。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链包含cDNA。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链包含基因组DNA。14.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述衔接子的所述核酸链由基因组DNA生成。15.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述衔接子的所述核酸链由无细胞核酸生成。16.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述衔接子的所述核酸链由来自细胞的核酸生成。17.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述衔接子的所述核酸链由来自生物样品的核酸生成。18.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述衔接子的所述核酸链由来自无细胞样品的核酸生成。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸链由RNA生成。20.根据权利要求19所述的方法，其进一步包括在步骤a)之前逆转录所述RNA。21.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述衔接子附加到核酸分子上，以生成包含所述衔接子的所述核酸链。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述附加通过连接进行。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述附加通过聚合酶链反应(PCR)进行。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述PCR用包含与所述第一衔接子互补的序列的寡核苷酸进行。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述寡核苷酸进一步包含与模板核酸的至少一部分互补的序列。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述寡核苷酸的3’端包含与所述模板核酸的所述至少一部分互补的所述序列。27.根据权利要求25所述的方法，其中与所述模板核酸的所述至少一部分互补的所述序列包含随机序列。28.根据权利要求25所述的方法，其中与所述模板核酸的所述至少一部分互补的所述序列包含与所述模板核酸的所述部分的完全互补性。29.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括在所述附加后纯化包含所述第一衔接子的所述核酸链。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述纯化包括在步骤a之前去除一个或多个未附加的衔接子。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述纯化包括酶消化所述一个或多个未附加的衔接子。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述酶消化包括使用外切核酸酶。33.根据权利要求31所述的方法，其中所述一个或多个未附加的衔接子包含尿嘧啶，其中所述去除所述一个或多个未附加的衔接子包括使用尿嘧啶-DNA糖基化酶、内切核酸酶或两者。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述纯化包括使用固相可逆固定来去除所述一个或多个未附加的衔接子。35.根据权利要求31所述的方法，其中所述纯化包括使用基于柱的固相提取来去除所述一个或多个未附加的衔接子。36.根据权利要求31所述的方法，其中所述纯化包括使用凝胶过滤。37.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤a)之前对包含所述衔接子的所述核酸链进行扩增。38.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤a)之前使包含所述第一衔接子的双链DNA分子变性，从而生成包含含有所述第一衔接子的所述核酸链的单链核酸。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述变性包括使用酶来降解所述双链DNA分子的链。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述酶是外切核酸酶。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述外切核酸酶是λ外切核酸酶。42.根据权利要求38所述的方法，其中所述变性包括：a)对所述双链DNA分子的链进行生物素化，以生成生物素化的双链DNA分子；b)使所述生物素化的双链DNA分子与链霉亲和素包被的表面结合；以及c)洗涤所述表面以释放非生物素化的DNA链，从而使所述双链DNA分子变性。43.根据权利要求38所述的方法，其中所述变性包括加热所述双链DNA分子。44.根据权利要求38所述的方法，其中所述变性包括碱变性。45.根据权利要求1所述的方法，其中所述延长序列包含随机序列。46.根据权利要求1所述的方法，其中所述延长序列与所述核酸序列的所述部分基本上或完全互补。47.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子条形码包含随机或半随机序列。48.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的所述多个核酸包含含有独特分子条形码的第一衔接子。49.根据权利要求40所述的方法，其中所述多个核酸中的所述第一衔接子进一步包含所述多个单链核酸中的每一个所共有的第二条形码。50.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述延伸的核酸中的所述延伸生成的3’延伸部分包含约100个碱基至约400个碱基的长度。51.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述延伸的核酸中的所述延伸生成的3’延伸部分包含约400个碱基至约500个碱基的长度。52.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将另外的衔接子附加...

【专利技术属性】
技术研发人员：图瓦尔·本耶海兹克尔，
申请(专利权)人：梅塔生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US