Fc结合性蛋白质及其制造方法技术

本发明专利技术提供与野生型相比对热、酸和/或碱的稳定性提高的Fc结合性蛋白质及其制造方法，此外，还提供将该蛋白质用作亲和色谱用配体，特异性地分离包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的方法。解决方法：通过将野生型人Fc受体的处于细胞外区域的1个以上的特定氨基酸残基取代成其他氨基酸残基，能够得到与野生型人Fc受体相比、对热、酸和/或碱的稳定性提高的Fc结合性蛋白质。本发明专利技术的Fc结合性蛋白质通过例如固定化于固相，作为亲和色谱用配体是有用的。此外，使用用包含编码本发明专利技术的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的表达载体转化的宿主，表达该蛋白质，则与使用野生型人Fc受体的情况相比，蛋白质的生产量提高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对免疫球蛋白具有亲和性的Fe结合性蛋白质。更具体地，本专利技术涉及能够作为例如亲和色谱用免疫球蛋白亲和性配体使用的、与野生型相比显示高热稳定性等特性的Fe结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、和使用该蛋白质作为构成要素的、吸附例如免疫球蛋白的吸附材料。
技术介绍
来自免疫球蛋白G(以下也称为IgG)的免疫信号通过抗原捕捉后的IgG与存在于免疫细胞表面的Fe受体结合而被传导。Fe受体是与IgG的Fe区域结合的一组蛋白质分子，各个分子种类具有属于免疫球蛋白超家族的Fe识别结构域，识别单一种类、或属于同一亚型的免疫球蛋白。由此确定各个免疫应答中哪种辅助细胞被动员(非专利文献I)。Fe受体还可以再分成亚型，作为针对IgG的受体，已经报告存在Fe yR1、Fc YRIIa、Fc YRIIb、Fe Y RIII (非专利文献I)。这其中，FcyRI与IgG的结合亲和性高，其平衡解离常数(Kd)为10_8M以下(非专利文献2)。FcyRI大体分为信号肽区域、细胞外区域、跨细胞膜区域、和细胞质内区域，与IgG的结合发生在IgG的Fe区域和Fe Y RI的细胞外区域，然后两者结合的信号传导至细胞质内。FcyRI由与IgG的结合直接相关的α链、以及Υ链这2种亚基构成，Y链通过位于跨细胞膜区域与细胞外区域的交界处的半胱氨酸介导的共价键形成同型二聚体(非专利文献I)。FcyRI的α链的氨基酸序列和基因碱基序列已由非专利文献3阐明，其后报告了通过基因重组技术以大肠杆菌(专利文献I)或动物细胞作为宿主细胞进行表达的例子(非专利文献4)。如前述，构成Fe Y RI的细胞外区域的蛋白质(以下也称为Fe结合性蛋白质)基于高度的亲和性具有针对人抗体`的良好的识别功能。在该高度的亲和性的基础上，对于Fe结合性蛋白质，已经报告了作为诊断试剂、抗体医药品的研究用工具或IgG等抗体医药品的制造步骤中利用的亲和色谱的配体加以应用的方法(专利文献I)。Fe结合性蛋白质是以在人体内发挥功能的蛋白质作为起源的蛋白质，与细菌的细胞表层等生物体外存在的蛋白质相比，因热、极端PH变化等而引起蛋白质变性的倾向强。另一方面，在将Fe结合性蛋白质作为用于IgG制备的亲和色谱用配体使用的情况下，在使用固定化有该配体的凝胶对通过色谱操作吸附的IgG进行洗脱时，该配体有时会暴露于柠檬酸缓冲液等低PH的溶液，因而该Fe结合性蛋白质需要对酸的稳定性。此外，在对该凝胶进行洗涤或再生的情况下，该配体还有时会暴露于氢氧化钠溶液等高PH溶液，因而该Fe结合性蛋白质又需要对碱的稳定性。而且，考虑到该凝胶的长期保存，该Fe结合性蛋白质还需要对热的稳定性。为了对蛋白质这样的生物体物质进行工业利用，有些情况下也需要通过对该生物体物质具有的天然结构进行改良，来重新制作在一定条件下稳定的物质。对于酶蛋白质等，已经报告了许多向其编码多核苷酸中人工导入突变，进行筛选后，取得获得了需要的性状的突变体的例子。然而，对于作为受体蛋白质的Fe结合性蛋白质，没有对热、酸或碱的稳定性提高的改良体的报告，迄今为止没有工业利用的例子。现有技术文献专利文献专利文献1:特表2002-531086号公报非专利文献非专利文献1:J. V. Ravetch 等，Annu. Rev.1mmunol. , 9,457,1991非专利文献2 :Toshiyuki Takai, Jpn. J. Clin. Tmmunol. , 28, 318, 2005非专利文献3 J.M. Alien 等，Science，243，378，1989非专利文献4 :A. Paetz 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，338,1811, 2005非专利文献5:夕 > 八夕質乃構造i機能，J 力卟 寸4工> 7 4 >夕一于'>彐于卟社，9，2005非专利文献6 :Molecular Cloning, Cold Spring Horbor Laboratory, 256,199
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术提供与野生型的人Fe受体Fe YRI相比，对热、酸和/或碱的稳定性提高了的Fe结合性蛋白质及其 制造方法。此外，本专利技术还提供使用该蛋白质作为亲和色谱用配体，特异性地分离含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质的方法。解决问题的方法本专利技术人对上述课题进行了深入研究，结果发现确定Fe结合性蛋白质中涉及结构稳定性的氨基酸残基，将该氨基酸残基取代成其他氨基酸残基而得到的突变体具有对热、酸和/或碱的良好稳定性，且作为亲和色谱用配体是有用的，从而完成了本专利技术。SP，本申请包含以下的(A)IK)记载的方案⑷一种Fe结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中的第16位至第289位的氨基酸，且该第16位至第289位的氨基酸序列中发生了以下( Γ(168)中的至少I个氨基酸取代(I)SEQ ID NO 1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸(2) SEQ ID NO 1的第25位的苏氨酸被取代成赖氨酸(3) SEQ ID NO 1的第38位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(4) SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(5) SEQ ID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成缬氨酸(6) SEQ ID NO 1的第63位的苏氨酸被取代成异亮氨酸(7) SEQ ID NO 1的第69位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸或苏氨酸(8) SEQ ID NO 1的第71位的精氨酸被取代成组氨酸(9) SEQ ID NO 1的第77位的缬氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸(IO)SEQ ID NO 1的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(11) SEQ ID NO 1的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸(12) SEQ ID NO 1的第100位的异亮氨酸被取代成缬氨酸(13) SEQ ID NO 1的第110位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(14) SEQ ID NO 1的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸(15) SEQ ID NO 1的第125位的组氨酸被取代成精氨酸(16) SEQ ID NO 1的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(17) SEQ ID NO 1的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸(18) SEQ ID NO 1的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸(19) SEQ ID NO 1的第160位的异亮氨酸被取代成甲硫氨酸(20) SEQ ID NO 1的第163位的天冬酰胺被取代成丝氨酸(21) SEQ ID NO 1的第195位的天冬酰胺被取代成苏氨酸(22) SEQ ID NO 1的第199位的苏氨酸被取代成丝氨酸(23) SEQ ID NO 1的第206位的天冬酰胺被取代成赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸(24) SEQ ID NO 1的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸(25) SEQ ID NO 1的第218位的亮氨酸被取代成缬氨酸(26) SEQ ID NO 1的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸 (27) SEQ ID NO 1的第248位的亮氨酸被取代成丝氨酸(28) SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成组氨酸(29) SEQ ID NO 1的第285位的亮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.10 JP 2010-052789;2011.02.24 JP 2011-038501. 一种Fe结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中的第16位至第289 位的氨基酸序列，且该第16位至第289位的氨基酸序列中发生了以下(1Γ(168)中的至少 I个氨基酸取代1)SEQID NO 1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸2)SEQ ID NO 1的第25位的苏氨酸被取代成赖氨酸3)SEQ ID NO 1的第38位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸4)SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸5)SEQ ID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成缬氨酸6)SEQ ID NO 1的第63位的苏氨酸被取代成异亮氨酸7)SEQ ID NO 1的第69位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸或苏氨酸8)SEQ ID NO 1的第71位的精氨酸被取代成组氨酸9)SEQ ID NO 1的第77位的缬氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸(10SEQIDNO 的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(11SEQIDNO 的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸(12SEQIDNO 的第100位的异亮氨酸被取代成缬氨酸(13SEQIDNO 的第110位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(14SEQIDNO 的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸(15SEQIDNO 的第125位的组氨酸被取代成精氨酸(16SEQIDNO 的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(17SEQIDNO 的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸(18SEQIDNO 的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸(19SEQIDNO 的第160位的异亮氨酸被取代成甲硫氨酸(20SEQIDNO 的第163位的天冬酰胺被取代成丝氨酸(21SEQIDNO 的第195位的天冬酰胺被取代成苏氨酸(22SEQIDNO 的第199位的苏氨酸被取代成丝氨酸(23SEQIDNO 的第206位的天冬酰胺被取代成赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸(24SEQIDNO 的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸(25SEQIDNO 的第218位的亮氨酸被取代成缬氨酸(26SEQIDNO 的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(27SEQIDNO 的第248位的亮氨酸被取代成丝氨酸(28SEQIDNO 的第283位的亮氨酸被取代成组氨酸(29SEQIDNO 的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(30SEQIDNO 的第17位的缬氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸(31SEQIDNO 的第19位的苏氨酸为异亮氨酸(32SEQIDNO 的第20位的苏氨酸为异亮氨酸(33SEQIDNO 的第25位的苏氨酸为甲硫氨酸或精氨酸(34SEQIDNO 的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或赖氨酸(35SEQIDNO 的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸(36SEQIDNO 的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸(37SEQIDNO1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(38SEQID NO :1的第42位的组氨酸被取代成亮氨酸(39SEQIDNO1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(40SEQID NO 1的第45位的缬氨酸被取代成丙氨酸(41SEQIDNO1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或色氨酸(42SEQIDNO1的第47位的组氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺(43SEQIDNO1的第49位的脯氨酸被取代成丝氨酸或丙氨酸(44SEQIDNO1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(45SEQIDNO1的第51位的丝氨酸被取代成丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨me (46SEQIDNO1的第52位的丝氨酸被取代成甘氨酸(47SEQIDNO1的第53位的丝氨酸被取代成亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸(48SEQIDNO1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(49SEQIDNO1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸(50SEQIDNO1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸(51SEQIDNO1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(52SEQIDNO1的第61位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(53SEQIDNO1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸(54SEQIDNO1的第63位的苏氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸(55SEQIDNO1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸(56SEQIDNO1的第65位的苏氨酸被取代成丙氨酸或缬氨酸(57SEQIDNO1的第66位的丝氨酸被取代成苏氨酸(58SEQIDNO1的第67位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(59SEQIDNO1的第69位的丝氨酸被取代成丙氨酸(60SEQIDNO1的第70位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸(61SEQIDNO:1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸(62SEQIDNO1的第73位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(63SEQIDNO1的第74位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸(64SEQIDNO1的第76位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(65SEQIDNO1的第77位的缬氨酸被取代成天冬氨酸或赖氨酸(66SEQIDNO1的第78位的天冬酰胺被取代成丝氨酸或甘氨酸 (67SEQIDNO1的第80位的丝氨酸被取代成丙氨酸(68SEQIDNO1的第84位的精氨酸被取代成丝氨酸(69SEQIDNO1的第88位的甘氨酸被取代成丝氨酸(70SEQIDNO1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸(71SEQIDNO1的第90位的丝氨酸被取代成甘氨酸(72SEQIDNO1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸(73SEQIDNO1的第96位的异亮氨酸被取代成缬氨酸或赖氨酸(74) SEQIDNOI的第(75) SEQIDNOI的第(76)SEQIDNOI的第(77) SEQIDNOI的第(78)SEQIDNOI的第(79)SEQIDNO1的第酸、苏氨酸或缬氨酸(80) SEQIDNOI的第(81) SEQIDNOI的第(82) SEQIDNOI的第(83) SEQIDNOI的第(84) SEQIDNOI的第(85) SEQIDNOI的第(86) SEQIDNOI的第(87) SEQIDNOI的第(88) SEQIDNOI的第(89) SEQIDNOI的第(90) SEQIDNOI的第(91) SEQIDNOI的第(92) SEQIDNOI的第(93) SEQIDNOI的第(94) SEQIDNOI的第(95) SEQIDNOI的第(96) SEQIDNOI的第(97) SEQIDNOI的第(98) SEQIDNOI的第(99) SEQIDNOI的第100)SEQIDNOI的第154101)SEQIDNOI的第156102)SEQIDNOI的第157103)SEQIDNOI的第159104)SEQIDNOI的第160105)SEQIDNOI的第161106)SEQIDNOI的第165107)SEQIDNOI的第171108)SEQIDNOI的第173109)SEQIDNOI的第174110)SEQIDNOI的第177IlDSEQIDNOI的第181137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸138位的酪氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：畑山耕太，朝冈义晴，田中亨，井出辉彦，
申请(专利权)人：公益财团法人相模中央化学研究所，东曹株式会社，
类型：
国别省市：