岩藻糖结合性蛋白、其制造方法、和其用途技术

课题在于，提供在大肠埃希氏菌等宿主中表达时的生产率、包含由Fucα1

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】岩藻糖结合性蛋白、其制造方法、和其用途


[0001]本专利技术涉及岩藻糖结合性蛋白、其制造方法、和其用途。本专利技术可以特别涉及在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等宿主中表达时的生产率、对包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GlcNAc和/或Fucα1
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2Galβ1
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3GalNAc构成的结构的糖链等含岩藻糖糖链的结合亲和性、和/或对热的稳定性得到提高的岩藻糖结合性蛋白。

技术介绍

[0002]源自由革兰氏阴性菌(伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia))产生的BC2L
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C凝集素的N末端结构域的BC2LCN为对包含岩藻糖残基的糖链具有结合亲和性的蛋白质，例如，已知其除了对非专利文献1、专利文献1和专利文献2中记载的已知为未分化糖链标志物的H型1型糖链(Fucα1
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2Galβ1
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3GlcNAc)和H型3型糖链(Fucα1
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2Galβ1
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3GalNAc)具有高结合亲和性以外，还对路易斯(Lewis)Y型糖链(Fucα1
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2Galβ1
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4(Fucα1
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3)GlcNAc)、路易斯(Lewis)X型糖链(Galβ1
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4(Fucα1
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3)GlcNAc)等包含岩藻糖残基的多种糖链具有高结合亲和性(非专利文献2)。另外还已知，BC2LCN与高表达H型1型糖链和H型3型糖链的未分化状态的人iPS细胞、人ES细胞进行结合，但与人体细胞不进行结合(非专利文献3)。而且，由于BC2LCN与上述未分化糖链标志物具有结合性，因此例如被用于包含未分化糖链标志物的复合糖的检测以及人iPS细胞、人ES细胞等未分化细胞的检测(专利文献1和专利文献2)。另外还已知，H型1型糖链在作为SSEA
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5而指定的癌细胞中是高表达的(非专利文献4)。
[0003]BC2LCN与已知的作为未分化细胞检测用抗体的抗Nanog抗体等具有同等的未分化干细胞检测能力(专利文献2)，但是BC2LCN与未分化细胞的糖链的结合基于静电相互作用，结合的强度会受到溶剂、盐浓度等外界环境的影响。因此认为，在上述未分化细胞和/或包含上述未分化糖链标志物的复合糖的检测中，该糖链与BC2LCN的结合亲和性有可能根据实验条件而降低，因此，需要提高了对上述未分化糖链标志物的结合亲和性的BC2LCN。
[0004]作为提高蛋白质的功能的方法，通过蛋白质工程方法向蛋白质中导入氨基酸变异而使目标功能提高的方法是公知的，例如，专利文献3记载了通过将特定的氨基酸残基置换为其他氨基酸残基而提高了对热、酸和/或碱的稳定性的Fc结合性蛋白。但是，迄今为止，不存在通过特定位置的氨基酸置换而提高了对热的稳定性、对糖链的结合亲和性的BC2LCN的相关报道。另外，为了实现BC2LCN的产业化应用，从稳定供给和大量供给的观点出发，优选利用大肠埃希氏菌等微生物进行制造之类的生产率高的方式，但是迄今为止不存在提高了生产率的BC2LCN的相关报道。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:WO2013/065302号
[0008]专利文献2:WO2013/128914号
[0009]专利文献3:日本特开2011
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206046号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Tateno,H等,Stem Cells Transl Med.2013,2(4)：265
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273.
[0012]非专利文献2:Sulak,O等,Structure.2010,18(1)：59
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72.
[0013]非专利文献3:Tateno,H等,J Biol Chem.2011,286(23)：20345
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20353.
[0014]非专利文献4:Tang,C等,Nat Biotechnol.2011,29(9)：829
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835

技术实现思路

[0015]专利技术要解决的问题
[0016]本专利技术的课题是提供具有优异性质的岩藻糖结合性蛋白。具体而言，本专利技术的课题可以是：提供在大肠埃希氏菌等宿主中表达时的生产率、对包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GlcNAc和/或Fucα1
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2Galβ1
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3GalNAc构成的结构的糖链等含岩藻糖糖链的结合亲和性、和/或对热的稳定性得到提高的岩藻糖结合性蛋白。
[0017]用于解决问题的方案
[0018]本专利技术的专利技术人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过在序列号1所示的由155个氨基酸残基构成的BC2LCN的氨基酸序列中使C末端侧的多个氨基酸残基缺失，从而在大肠埃希氏菌中表达时的生产率得到极大提高。另外，本专利技术的专利技术人们发现，通过将序列号1所示的氨基酸序列的第39位的谷氨酰胺残基置换为亮氨酸残基或甲硫氨酸残基、和/或将序列号1所示的氨基酸序列的第65位的谷氨酰胺残基置换为亮氨酸残基、和/或将序列号1所示的氨基酸序列的第72位的半胱氨酸残基置换为甘氨酸残基或丙氨酸残基，从而得到提高了对热的稳定性的岩藻糖结合性蛋白。另外，本专利技术的专利技术人们发现，通过将序列号1所示的氨基酸序列的第81位的谷氨酸残基置换为半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、组氨酸残基、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、丝氨酸残基、异亮氨酸残基、酪氨酸残基、甘氨酸残基、脯氨酸残基、亮氨酸残基、或天冬酰胺残基，从而得到提高了对包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GlcNAc和/或Fucα1
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2Galβ1
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3GalNAc构成的结构的糖链的结合亲和性的岩藻糖结合性蛋白。另外，本专利技术的专利技术人们发现，通过将序列号1所示的氨基酸序列的第36位的甘氨酸残基置换为半胱氨酸残基，从而抑制了在C末端添加有包含一个以上的半胱氨酸残基的寡肽而制造蛋白时的、由形成二硫键而导致的二聚物的生成。本专利技术的专利技术人们基于这些发现，从而完成了本专利技术。
[0019]即，本专利技术包含例如以下的[1]～[24]所述的专利技术。
[0020][1]一种岩藻糖结合性蛋白，其为包含以下的(a)～(d)中的任一者所记载的氨基酸序列的岩藻糖结合性蛋白，
[0021]所述岩藻糖结合性蛋白对包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GlcNAc构成的结构的糖链和/或包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GalNAc构成的结构的糖链具有结合亲和性，
[0022]其中，排除包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种岩藻糖结合性蛋白，其为包含以下的(a)～(d)中的任一者所记载的氨基酸序列的岩藻糖结合性蛋白，所述岩藻糖结合性蛋白对包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GlcNAc构成的结构的糖链和/或包含由Fucα1
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2Galβ1
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3GalNAc构成的结构的糖链具有结合亲和性，其中，排除包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白，(a)序列号1所示的氨基酸序列中的第1位的脯氨酸残基至第X位的氨基酸残基的氨基酸序列，其中，X为110以上且140以下的整数；(b)在序列号1所示的氨基酸序列中的第1位的脯氨酸残基至第X位的氨基酸残基的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸残基的缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸序列，其中，X为110以上且140以下的整数；(c)相对于序列号1所示的氨基酸序列中的第1位的脯氨酸残基至第X位的氨基酸残基的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列，其中，X为110以上且140以下的整数；(d)在所述(a)～(c)中的任一者所记载的氨基酸序列中包含特定的氨基酸置换的氨基酸序列，其中，该特定的氨基酸置换为选自以下的(1)～(5)中记载的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：(1)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第39位的谷氨酰胺残基的氨基酸残基向谷氨酰胺残基以外的氨基酸残基的置换；(2)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第72位的半胱氨酸残基的氨基酸残基向半胱氨酸残基以外的氨基酸残基的置换；(3)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第65位的谷氨酰胺残基的氨基酸残基向谷氨酰胺残基以外的氨基酸残基的置换；(4)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第81位的谷氨酸残基的氨基酸残基向谷氨酸残基以外的氨基酸残基的置换；(5)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第36位的甘氨酸残基的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的置换。2.根据权利要求1所述的岩藻糖结合性蛋白，其中，所述(1)～(5)中记载的氨基酸置换分别为以下的(6)～(10)中记载的氨基酸置换：(6)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第39位的谷氨酰胺残基的氨基酸残基向亮氨酸残基或甲硫氨酸残基的置换；(7)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第72位的半胱氨酸残基的氨基酸残基向甘氨酸残基或丙氨酸残基的置换；(8)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第65位的谷氨酰胺残基的氨基酸残基向亮氨酸残基的置换；(9)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第81位的谷氨酸残基的氨基酸残基向半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、组氨酸残基、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、丝氨酸残基、异亮氨酸残基、酪氨酸残基、甘氨酸残基、脯氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基的置换；(10)相当于序列号1所示的氨基酸序列的第36位的甘氨酸残基的氨基酸残基向半胱氨酸残基的置换。3.根据权利要求1或2所述的岩藻糖结合性蛋白，其全长为95～175个残基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的岩藻糖结合性蛋白，其中，所述(a)～(d)中记载的氨基酸序列的长度为95～155个残基。5.根据权利要求1～4中任一项所述的岩藻糖结合性蛋白，其包含序列号2～序列号16中任一者所示的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5中任一项所述的岩藻糖结合性蛋白，其中，在N...

【专利技术属性】
技术研发人员：林政浩，丸山高广，伊藤博之，浅越绫，畑山耕太，穗谷惠，
申请(专利权)人：公益财团法人相模中央化学研究所，
类型：发明
国别省市：