一种抗菌肽及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种抗菌肽niS1及其基因和应用。本发明专利技术提供了一种新的抗菌肽niS1，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明专利技术还提供了编码上述抗菌肽niS1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供的抗菌肽niST1对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌都具有显著的杀菌活性。对编码抗菌肽niS1的基因进行优化，构建重组表达载体pPICZαA

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽及其基因和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种抗菌肽niS1及其基因和抗菌活性检测。

技术介绍

[0002]自然界中各类生物都具有其内在的防御系统，当机体受到外界微生物侵染时，该系统便会产生一类防御性的肽类活性物质，被称为抗菌肽(antimicrobial peptides)，一般含有30
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45个氨基酸残基，主要分布于皮肤和黏膜上皮，阻止病原微生物的定植并通过结合于病原微生物的胞膜上而将其杀灭。抗菌肽是一种小的阳离子肽，是天然宿主识别微生物的基础。截止目前研究发现抗菌肽的种类有：微生物抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、昆虫抗菌肽和植物抗菌肽。
[0003]抗菌肽的分子结构是一类分子量为3
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4KDa的非糖基两亲(亲水、亲脂)低分子短肽，由30
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100个氨基酸组成，一般富含精氨酸，带正电荷。分子中有6个半胱氨酸残基，形成3对二硫键，含有3个相应对称的β折叠片结构，缺少α螺旋结构域。
[0004]借助于细胞这个媒介，无论在细胞内或细胞外，抗菌肽都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物。在细胞内环境中，它们通过吞噬微生物而促成厌氧菌的死亡。当被释放到细胞外环境中，它们通过攻击微生物外膜发挥抗菌活性。除此之外，抗菌肽还作为机体内外免疫系统的“仲裁者”进行免疫调节以及创伤和神经损伤的修复。抗菌肽在宿主的嗜中性粒细胞、粘膜表面、皮肤和其他上皮细胞免疫中起重要作用，其定位和调控是通过抵抗病原的侵袭和内生细菌的生长两种途径来实现。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种抗菌肽niS1。
[0006]本专利技术的再一目的是提供编码上述抗菌肽的基因niS1。
[0007]本专利技术的再一目的是提供包含上述抗菌肽基因的重组载体。
[0008]本专利技术的再一目的是提供包含上述抗菌肽基因的重组菌株。
[0009]本专利技术的再一目的是提供一种制备抗菌肽的方法。
[0010]本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新抗菌肽。本专利技术人通过分子设计得到一个新的具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的抗菌肽。适合于饲料、食品、医药等行业中使用。
[0011]从解淀粉芽胞杆菌中获得了一种抗菌肽niS1，该蛋白含有58个氨基酸和一个终止密码子。理论分子量为6.5kDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0012]mskfdd vvkvsfdlddftcdldkqdsk itpqwcvsv ctpgtgvl qflqtitc nchisk
[0013]本专利技术还提供了编码上述抗菌肽的基因。本专利技术通过PCR的方法分离克隆了这一抗菌肽基因niS1，全长177bp，全基因序列如SEQ ID NO.2所示：
[0014]ATGAGCAAATTTGATGATGTGGTGAAAGTGAGCTTTGATCTGGATGATTTTACCTGCGATCTGGATAAA
CAGGATAGCAAAATTACCCCGCAGTGGTGCGTGAGCGTGTGCACCCCGGGCACCGGCGTGCTGCAGTTTCTGCAGACCATTACCTGCAACTGCCATATTAGCAAATAA
[0015]将抗菌肽基因niS1的DNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。发现与来源Bacillus amyloliquefaciens的抗菌肽的一致性为69％,与来源Bacillus nakamurai的抗菌肽的一致性为68％。说明niS1是一种新的抗菌肽，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。
[0016]本专利技术还提供了包含上述抗菌肽基因niS1的重组载体，优选为pPICZαA
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niS1。将本专利技术的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将抗菌肽基因插入到质粒pPICZαA上的EcoRI和BamHI限制性酶切位点之间，得到重组真核细胞表达质粒pPICZαA
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niS1。
[0017]本专利技术还提供了包含上述抗菌肽基因niS1的表达菌株，优选为毕赤酵母。
[0018]本专利技术还提供了一种制备上述抗菌肽niS1的方法，包括以下步骤：
[0019]1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒；
[0020]2)转化质粒，通过毕赤酵母表达得到抗菌肽niS1；
[0021]3)检测所得抗菌肽niS1的抗菌活性。
[0022]本专利技术的抗菌肽金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌作用，其对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抗菌活性。做为一种新型的抗菌肽，在饲料添加剂、食品和兽药等行业都有应用价值。
附图说明
[0023]图1本专利技术抗菌肽niS1对金黄色葡萄球菌的活性检测。
[0024]图2本专利技术抗菌肽niS1对大肠杆菌的活性检测。
具体实施方式
[0025]试验材料和试剂
[0026]1、载体及宿主细胞：载体ppicza购自于Invitrogen公司，GS115购自Invitrogen公司。
[0027]2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Takara公司，反转录试剂盒购自TOYOBO公司，大提质粒试剂盒购自QIAGEN公司，细胞培养相关试剂购自Invitrogen公司。其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0028]3、培养基：大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0029]实施例1抗菌肽编码基因的克隆
[0030]提取解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA。根据发表的解淀粉芽孢杆菌抗菌肽DNA序列比对设计合成PCR引物niS
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F ATGAGCAAATTTGAT和niS
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R AUUAGCAAAUAA,以解淀粉芽孢杆菌的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，55
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50℃20sec(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，72℃10s，32个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，50℃
30sec，72℃30s，28个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测，得到约200bp的片段，回收后pGEM
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T Easy载体相连并转化大肠杆菌JM109，经检测为阳性后送测序。
[0031]根据测定序列结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽niS1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：mskfdd vvkvsfdlddftcdldkqdsk itpqwcvsv ctpgtgvl qflqtitc nchisk。2.一种抗菌肽基因niS1，其特征在于，编码权利要求1所述的抗菌肽niS1。3.根据权利要求2所述抗菌肽基因niS1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2：ATGAGCAAATTTGATGATGTGGTGAAAGTGAGCTTTGATCTGGATGATTTTACCTGCGATCTGGATAAACAGGATAGCAAAATTACCCCGCAGTGGTGCGTGAGCGTGTGCACCCCGGGCACCGGCGTGCTGCAGTTTCTGCAGACCATTACCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴培均，罗建杰，李富伟，
申请(专利权)人：内蒙古科为博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：