一种耐高温酸性α-淀粉酶及其基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种α

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温酸性
α
‑
淀粉酶及其基因和应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种耐高温酸性α
‑
淀粉酶AMY
‑
L18及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

技术介绍

[0002]淀粉是一种碳水化合物，几乎完全是以α
‑
D
‑
葡萄糖为单位聚合组成的，链的平均长度为500
‑
1000个葡萄糖残基。淀粉中能溶于热水的一部分叫直链淀粉，不能溶解的叫支链淀粉，这两种成分是淀粉颗粒的主要成分，含量可以达到75
‑
80％。淀粉几乎存在于所有绿色植物多数组织中，是植物营养物质的一种储存形式，在显微镜下以颗粒形状存在于植物有机体中。当前，能够作为淀粉原料的主要作物是玉米，其次是薯类、稻谷和小麦。淀粉酶是可以水解淀粉的一类酶的总称，广泛存在于植物和微生物中。根据淀粉降解酶的作用方式主要分为三类：外切淀粉酶、内切淀粉酶和分支淀粉酶。在实际生产中最常使用的主要是α
‑
淀粉酶、β
‑
淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、支链淀粉酶。其中，α
‑
淀粉酶是从淀粉内部任意水解α
‑
1,4
‑
D葡萄糖苷键，导致淀粉部分解聚，是内切酶。根据α
‑
淀粉酶的热稳定性和最适反应温度，通常把α
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淀粉酶分成高温α
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淀粉酶、中温耐热型α
‑
淀粉酶、非耐热性α
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淀粉酶和低温α
‑
淀粉酶。高温α
‑
淀粉酶作用最适温度90
‑
100℃，95
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105℃耐热性好，中温耐热型α
‑
淀粉酶作用最适温度70
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80℃，90℃以上处理一般会失活，非耐热性α
‑
淀粉酶作用最适温度50℃左右，低温α
‑
淀粉酶则一般在10
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20℃还能表现出活性。根据α
‑
淀粉酶作用的最适pH和对酸碱的稳定性，把α
‑
淀粉酶分成酸性α
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淀粉酶、中性α
‑
淀粉酶和碱性α
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淀粉酶。大多数α
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淀粉酶都属于中性α
‑
淀粉酶，一般最适pH 6.0
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7.0，酸性α
‑
淀粉酶最适pH<5.5，碱性α
‑
淀粉酶最适pH>8.0。
[0003]对淀粉酶的研究已有半个世纪，主要研究集中在适合于麦芽糖浆、食品烘培、纺织退浆工业等方面的淀粉酶，已经从不同来源的植物与微生物中分离到大量的不同类型不同功能的淀粉酶，并分离出多种淀粉酶基因，现已工业化生产多种淀粉酶产品。近年来，耐高温淀酸性粉酶已经引起研究人员的广泛关注，在饲料、玉米淀粉深加工、氨基酸和有机酸发酵中添加淀粉酶已经很普遍了，缺乏耐高温性能优异，并且具有在酸性条件酶活较高的淀粉酶。目前许多工业用淀粉酶最适温度要105℃左右甚至更高，要求在酸性条件下酶活稳定，并且具有很好的降解效果。因此，急需开发在高温和酸性条件下，对淀粉也能发挥显著水解作用的高效淀粉酶。此外，在动物饲料行业添加耐高温酸性的淀粉酶更有利于在动物胃肠的酸性环境中发挥水解作用，有助于营养物质的吸收。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种耐高温酸性α
‑
淀粉酶。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种α
‑
淀粉酶。
[0006]所述的α
‑
淀粉酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1。
[0007]在GenBank中进行BLAST比对，该序列与来源于Bacillus thuringiensis的α
‑
淀粉
酶氨基酸序列一致性为63％，本专利技术同时保护与SEQ ID NO.1具有63％以上同一性的序列。
[0008]优选地，所述的α
‑
淀粉酶N端还包含信号肽，所述的信号肽的序列为SEQ ID NO.2。
[0009]优选地，所述的α
‑
淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3有63％以上同一性的序列。
[0010]另一方面，本专利技术提供了一种核苷酸序列。
[0011]所述的核苷酸序列编码前述的α
‑
淀粉酶。
[0012]优选地，所述的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013]所述的与SEQ ID NO.4编码相同氨基酸序列的核苷酸序列是指在密码子简并性的基础上对SEQ ID NO.4进行碱基替换的序列。
[0014]优选地，所述的核苷酸序列还包括编码信号肽的序列。
[0015]所述的编码信号肽的序列为SEQ ID NO.5或与SEQ ID NO.5编码相同信号肽的序列。
[0016]所述的与SEQ ID NO.5编码相同信号肽的序列是指在密码子简并性的基础上对SEQ ID NO.5进行碱基替换后的序列。
[0017]优选地，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
[0018]再一方面，本专利技术提供了一种重组载体。
[0019]所述的重组载体包含前述的核苷酸序列。
[0020]优选地，所述的重组载体为pPIC
‑
amy
‑
L18，即前述核苷酸序列插入pPIC载体构建的重组载体。
[0021]所述的重组载体的构建中包括：将本专利技术的α
‑
淀粉酶基因去掉信号肽后插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。
[0022]作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本专利技术的α
‑
淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组毕赤酵母表达质粒pPIC9
‑
amy
‑
L18。
[0023]又一方面，本专利技术提供了一种细胞。
[0024]所述的细胞中包括前述的重组载体。
[0025]所述的细胞用于表达前述的α
‑
淀粉酶。
[0026]所述的细胞可以为工程菌或具有蛋白表达能力的任何细胞。
[0027]优选地，所述的细胞为重组菌株；优选菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌；更优选为重组菌株GS115/amy
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L27，即表达本专利技术所述的α
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淀粉酶基因的毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115。
[0028]又一方面，本专利技术提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
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淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列包括SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有63％以上同一性的序列。2.根据权利要求1所述的α
‑
淀粉酶，其特征在于，还包括N端的信号肽，所述的信号肽的序列为SEQ ID NO.2。3.根据权利要求2所述的α
‑
淀粉酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有63％以上同一性的序列。4.一种核苷酸序列，其特征在于，编码权利要求1
‑
3任一项所述的α
‑
淀粉酶。5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于，还包括编码信号肽的序列，所述编码信号肽的序列为SEQ ID NO.5或与SEQ ID NO.5编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。7.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求4
‑
6任一项所述的核苷酸序列。8.一种细胞，其特征在于，所述的细胞中包括权利要求7所述的重组载体。9.一种α
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淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括使用重组细胞表达权利要求1
‑
3任一项所述的α
‑
淀粉酶。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴培均，罗建杰，李富伟，门佳轩，
申请(专利权)人：内蒙古科为博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：