一种定点突变的α-葡萄糖苷酶制造技术

本发明专利技术属于基因工程和蛋白质工程技术领域，公开了一种定点突变的α

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变的
α
‑
葡萄糖苷酶


[0001]本专利技术属于基因工程和蛋白质工程
，涉及一种定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶及其应用。

技术介绍

[0002]L
‑
抗坏血酸(L
‑
ascorbic acid)又称维生素C(Vitamin C，L
‑
AA，VC)，是人体必需的维生素和天然抗氧化剂，具有保护作用的抗氧化剂，在维持人体健康中承担重要的角色。此外，维生素C对皮肤的保养有一定的功效，经过多年的发展，目前维生素C在全球食品和化妆品行业得到广泛应用。但是VC的理化性质极其不稳定，其2号碳上的氢氧根非常容易氧化还原反应而发生降解，导致维生素C的生理活性迅速减弱甚至失活。2
‑
O
‑
D
‑
吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA
‑
2G)是一种维生素C的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的维生素C替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。
[0003]α
‑
葡萄糖苷酶(α
‑
glucosidase，AG，EC 3.2.1.20)，又称α
‑
D
‑
葡萄糖苷水解酶，是最早发现能产生2
‑
O
‑
D
‑
吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA
‑
2G)的酶。不像环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)合成AA
‑<br/>2G过程中容易产生副产物AA
‑
2Gn(n是连在L
‑
抗坏血酸的2号碳上的糖基个数)，相比于其他AA
‑
2G的生物合成法，α
‑
葡萄糖苷酶合成AA
‑
2G的副产物已经属于较少的一类，但是主要副产物AA
‑
6G的存在，会给AA
‑
2G的分离纯化带来极大的困难，如综述文献(https://doi.org/10.1007/s00253
‑
012
‑
4150
‑
9)报道：α
‑
葡萄糖苷酶的转糖苷反应容易产生副产物AA
‑
6G，影响了该酶的应用。另外，α
‑
葡萄糖苷酶合成AA
‑
2G的效率很低。如名称为“一种α
‑
糖苷酶基因突变体及在制备2
‑
O
‑
α
‑
D
‑
葡萄糖基
‑
L
‑
抗坏血酸中的应用”的专利技术专利申请(公开号：CN112695021A)，该专利申请公开了粳稻α
‑
葡萄糖苷酶的五种突变体，实现了催化生成AA
‑
2G的产量的提高。该专利技术针对产量的提高进行了研究，但未涉及减少AA
‑
6G副产物的改进。
[0004]6‑
O
‑
D
‑
吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA
‑
6G)，是维生素C的6号碳上连接上一个葡萄糖分子的维生素C的糖类衍生物，与AA
‑
2G是同分异构体(AA
‑
2G的紫外光最大吸收波长为238nm，AA
‑
6G紫外光最大吸收波长为243nm，紫外光最大吸收波长是区分AA
‑
2G和AA
‑
6G的一个指标。参考文献DOI：10.1080/00021369.1990.10870201)，极难用一般的分离方法进行分离。副产物AA
‑
6G的存在极大的限制了α
‑
葡萄糖苷酶在合成AA
‑
2G中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的是提供一种定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶，它可被作为催化酶，利用麦芽糖以及L
‑
抗坏血酸做为底物合成AA
‑
2G且无副产物AA
‑
6G，且提高了AA
‑
2G产量。
[0006]本专利技术是对粳稻α
‑
葡萄糖苷酶(称为JrAG基因)进行定点突变，由粳稻(Oryza sativa Japonica Group)中获得定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶，
[0007]本专利技术所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α
‑
葡萄糖苷酶中制造两个氨基酸取代而产生的；所述的氨基酸取代是第120位和第215位的取
代。
[0008]本专利技术是通过蛋白质工程技术对粳稻α
‑
葡萄糖苷酶(Japonica riceα
‑
D
‑
Glucosidase，JrAG)的两个位点的氨基酸残基进行改造后得到的一种新的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶。JrAG的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0009]根据本专利技术所述的定点突变改造的α
‑
葡萄糖苷酶的进一步特征，所述第120位的取代是精氨酸突变为丝氨酸，所述第215位的取代是酪氨酸突变为色氨酸，简称为R120S/Y215W；所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术的另一个目的是提供一种DNA分子，其编码所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶。
[0011]优选地，所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其含有本专利技术所述的DNA分子。
[0013]本专利技术的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本专利技术所述的DNA分子，或者含有本专利技术所述的载体。
[0014]上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。
[0015]本专利技术优选的宿主为真核系统如毕赤酵母GS115；本专利技术优选的目的基因表达载体为pPIC3.5k。
[0016]本专利技术还提供了所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶的生产方法，包括：在适于α
‑
葡萄糖苷酶表达的条件下培养本专利技术所述的宿主细胞，并从宿主细胞中分离所述的α
‑
葡萄糖苷酶。
[0017]本专利技术还提供了所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶的用途。
[0018]本专利技术所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶可应用于制备2
‑
O
‑
α
‑
D
‑
葡萄糖基
‑
L
‑
抗坏血酸。具体地，以本专利技术所述的所述的α
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶，其特征在于：所述定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α
‑
葡萄糖苷酶中制造两个氨基酸取代而产生的；所述的氨基酸取代是第120位和第215位的取代。2.根据权利要求1所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶，其特征在于：所述第120位的取代是精氨酸突变为丝氨酸，所述第215位的取代是酪氨酸突变为色氨酸；所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的定点突变的α
‑
葡萄糖苷酶。4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，周伟杰，刘大岭，谢春芳，刘桂祯，黄炯威，莫世艺，
申请(专利权)人：开平牵牛生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：