一种古菌高温淀粉酶及其应用制造技术

一种古菌高温淀粉酶及其应用，涉及淀粉酶。通过将来源于深海超嗜热古菌太平洋火球菌(Palaecoccus pacificus DY20341

【技术实现步骤摘要】
一种古菌高温淀粉酶及其应用


[0001]本专利技术涉及淀粉酶，尤其是涉及一种古菌高温淀粉酶及其应用。

技术介绍

[0002]淀粉酶(Amylase)是一类降解淀粉和糖原的酶类总称，其水解淀粉分子链中的仅α
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1,4
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葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精、寡糖和少量麦芽糖和葡萄糖，其广泛地存在于植物、动物和微生物中。高温淀粉酶通常是指在最适酶活温度在60℃以上的淀粉酶，高温淀粉酶具有高温条件下热稳定性强，保存条件广，节约能源，降低成本，易于保存和运输等特点，被广泛应用于生产淀粉糖(葡萄糖、饴糖、糊精、果糖、低聚糖)、酒精、啤酒、味精、食品酿造、发酵工业、去污、纺织等行业。目前在工业上大量使用的α
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淀粉酶主要来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(MEGAZYME,E
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BLAAM),解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens(MEGAZYME,E
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BAASS),枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.str.168(PROZOMIX,PRO
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E0403)，黑曲霉Aspergillus niger和米曲霉Aspergillus oryzae；其中地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(MEGAZYME,E
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BLAAM)由于其具有相当高的热稳定性而被广泛使用，其最适酶活温度为75℃，酶活在80℃以下可以维持稳定，最适pH为6.0～6.5，在pH4.5～8.0范围内具有活力。
[0003]本专利技术所涉及的超嗜热古菌太平洋火球菌Palaecoccus pacificus DY20341
T
属于热球菌目，分离自东太平洋火山热液区[1]。热球菌目是深海热液区一类常见的超嗜热古菌，其可以利用蛋白质、多糖类进行异养代谢，具有丰富的碳水化合物降解系统，包括对淀粉、糖原、多糖的降解。已报道的来源于热球菌目的高温淀粉酶都具有嗜热、耐酸的特性，如Pyrococcus furious，Pyrococcus woesei，Thermococcus onnurineus NA1，Thermococcus sp.HJ21。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种古菌高温淀粉酶AmyPap及其应用。通过将来源于深海超嗜热古菌太平洋火球菌(Palaecoccus pacificus DY20341
T
)的淀粉酶基因，经序列优化后转入大肠杆菌(Escherichia coli)中，构建得到高效重组表达淀粉酶的工程菌株，并通过对重组蛋白酶学特性分析确定其应用范围。
[0005]古菌高温淀粉酶AmyPap基因的分子类型为DNA，序列特征：长度为1311bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性。其核苷酸序列采用以下方法获得：运用基因组分析获得完整开放阅读框(ORF)，去信号肽和密码子优化后，且序列首尾携带酶切位点NdeI和XhoI，合成得到AmyPap，记为SEQ ID No.1，所述SEQ ID No.1如下：
[0006][0007]所述高温淀粉酶AmyPap基因的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为453aa，类型为氨基酸，序列记为SEQ ID No.2，如下所示：
[0008][0009][0010]一种古菌高温淀粉酶AmyPap基因的表达方法，包括以下步骤：
[0011]1)构建高温淀粉酶AmyPap基因的重组表达工程菌，所述的载体为pET
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28a
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AmyPap，培养细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；
[0012]2)提供高温淀粉酶AmyPap大量表达方法。
[0013]所述古菌高温淀粉酶AmyPap的应用范围，包括pH、温度、金属离子等。
[0014]酶活pH作用范围为pH4.5～9.5，最适pH5.5～6.5；酶活温度作用范围为55～99℃，最适60～80℃；其可以耐受长时间的高温处理，其酶活作用可以不依赖于金属离子。
[0015]所述高温淀粉酶AmyPap可在酒精酿造、味精、淀粉糖行业的应用，但不限于在食品工业的应用。
[0016]本专利技术提供来自深海热液区的超嗜热古菌太平洋火球菌Palaeococcus pacificus DY20341
T
的AmyPap基因及其重组表达工程菌，表达后蛋白具有广泛的高温作用范围(50～99℃)且热稳定性高的特点。所述淀粉酶AmyPap在温度55～99℃范围内能保持80％以上酶活，具有相对较高的热稳定性。AmyPap活性不依赖于Ca
2+
，Mg
2+
等金属离子。
附图说明
[0017]图1为耐高温淀粉酶AmyPap基因重组表达的SDS
‑
PAGE电泳图谱。重组载体pET
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28a
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AmyPap，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。在图1中，M:蛋白Marker；line1：未诱导表达的总蛋白；line2：20度培养诱导表达后的上清总蛋白；line3：20度培养诱导表达后的沉淀总蛋白；line4：37度培养诱导表达后的上清总蛋白；line5：37度培养诱导表达后的沉淀总蛋白。
[0018]图2为高温淀粉酶AmyPap的酶学特性(pH值对重组淀粉酶AmyPap的影响)。
[0019]图3为高温淀粉酶AmyPap的酶学特性(温度对重组淀粉酶AmyPap的影响)。
具体实施方式
[0020]以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(15、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
[0021]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案，其具体步骤是：
[0022]1.构建高温淀粉酶AmyPap基因表达工程菌
[0023]由于全基因组序列分析得知完整的高温淀粉酶AmyPap，去除信号肽序列，并优化密码子后委托某公司直接合成两端携带酶切位点的AmyPap，合成的AmyPap基因与pET
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28a分别进行NdeI和XhoI双酶切，二者酶切产物纯化后连接过夜并转化大肠杆菌Top10，菌落PCR后挑取2～3个阳性菌落摇菌培养提取质粒并测序检测。阳性克隆表达质粒命名为pET
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28a
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AmyPap。用表达质粒pET
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28a
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AmyPap电转化大肠杆菌BL21(DE3)，选取阳性菌落作为重组菌株，命名为BL21
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pET
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28a...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种古菌高温淀粉酶，其特征在于为古菌高温淀粉酶AmyPap，来源于深海超嗜热古菌太平洋火球菌Palaecoccus pacificus DY20341
T
的淀粉酶基因，经序列优化后用于原核表达重组的核苷酸序列，长度为1311bp，类型为核苷酸，序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述一种古菌高温淀粉酶AmyPap基因，其特征在于其分子类型为蛋白质，序列特征：长度为453aa，类型为氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示。3.如权利要求1所述一种古菌高温淀粉酶AmyPap基因的表达方法，其特征在于包括以下步骤：1)构建高温淀粉酶AmyPap的重组表达载体pET
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【专利技术属性】
技术研发人员：曾湘，邵宗泽，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：