一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用，所述糖苷酶是经过分析对比整合得到的如SEQ No.1所示氨基酸序列的α

【技术实现步骤摘要】
一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种枸杞来源的α
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糖苷酶及其在生产2
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O
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α
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D
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葡萄糖基
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L
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抗坏血酸中的应用。

技术介绍

[0002]α
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糖苷酶即α
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葡萄糖苷酶(α
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glycosidase)为淀粉水解酶类中的一种，它可从多糖的非还原末端水解底物的α
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葡萄糖苷键，产生α
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D
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葡萄糖，该酶还具备转糖苷酶活性，能够以麦芽糖等糖基供体，催化糖基化反应，修饰多种含羟基的受体化合物。目前，α
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葡萄糖苷酶已广泛应用于包括淀粉水解、酒精发酵和化学合成等
但是目前开发出的工业应用类α
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葡萄糖苷酶，尤其是具备较高的转糖苷活性的酶类，还十分有限，人们迫切的需要开发出更多，具备工业所需酶学性质的α
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葡萄糖苷酶新酶。
[0003]维生素C（缩写为VC）又名L
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抗坏血酸，具有抑制黑色素合成，促进胶原蛋白合成以及抗氧化等多种生理功能，人体不能自身合成，只能靠食物或药物提供。但是VC本身稳定性很差，其在水溶液中极不稳定；易被空气中的氧和其他氧化剂氧化；暴露于中性pH、热、光和重金属下会快速降解等,从而限制了它在某些领域中的应用。
[0004]L
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抗坏血酸葡萄糖苷（AA
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2G）是维生素C的一种衍生物，是公认的最为稳定的VC衍生物，VC分子上2位C上的羟基被吡喃型葡萄糖苷取代，经过皮肤上α
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葡萄糖苷酶的作用，L
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抗坏血酸葡萄糖苷所含的VC可慢慢被水解出来，逐渐发挥VC的生理活性功能，水解后的VC与天然VC有完全相同的结构和生理活性。
[0005]利用糖基转移酶的特异性转糖基作用进行生物转化合成是目前维生素C葡萄糖苷的唯一生产途径。目前所报道的AA
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2G生物催化用酶主要有α
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葡萄糖苷酶（EC 3 .2 .1 .20，α
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Glucosidase）、环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC 2 .4 .1 .19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，简称CGTase）、α
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淀粉酶（EC 3 .2 .1 .1，α
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Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2 .4 .1 .7，Sucrose phosphorylas）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2 .4 .1 .5，Dextransucrase）、α
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异麦芽糖基葡糖基形成酶等六类酶。
[0006]CGTas是目前最常用于合成AA
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2G的酶，该酶能够以的α
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环糊精为底物合成AA
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2G。但与麦芽糖、可溶性淀粉等来源广泛的底物相比，α
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环糊精的价格相对较高。有研究者利用可溶性淀粉和麦芽糊精等较为廉价的底物，通过CGTase合成AA
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2G，但产量较低，普遍在2－3 g/L左右。并且，用CGTase催化首先得到的是AA系列衍生物，还需要经酶解等后处理过程才能获得AA
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2G。1990年，NorioMuto等首次发现大米来源的α
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糖苷酶能够以成本较低的麦芽糖为糖基供体，特异性催化L
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AA合成AA
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2G。但相关研究较少。
[0007]利用α
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糖苷酶催化合成AA
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2G具有反应简单，底物价廉易得，且产物单一易于分离纯化的特点。本专利旨在发掘新的生物催化剂α
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糖苷酶，且用于催化合成AA
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2G，为AA
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2G生产工艺的多样性及可能性奠定基础。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供一种新的来源于枸杞的α
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葡萄糖苷酶，所述α
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葡萄糖苷酶包含SEQ No.1所示的氨基酸序列。
[0009]所述来源于枸杞的α
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葡萄糖苷酶能够将L
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AA转化为AA
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2G。
[0010]本专利技术提供编码该酶的多核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ No.2所示。
[0011]一种携带该多核苷酸的重组载体。
[0012]含有该重组载体的重组细胞。
[0013]用于生产AA
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2G的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组中的一种及以上：酶、编码所述酶的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体和含有所述重组载体的重组细胞。
[0014]使用选自由以下组成的组中的一种及以上生产AA
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2G的方法；酶、编码所述酶的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体和含有所述重组载体的重组细胞。
[0015]对枸杞果实进行转录组测序分析，将序列结果与NR、NT、SwissProt、KOG、KEGG、GO、InterPro功能数据库进行比对注释，确定出一条功能注释为α
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糖苷酶的多核苷酸序列。
[0016]另外，将该多核苷酸插入重组载体中，并使其表达以提供具有由L
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AA生产AA
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2G的活性的酶，从而完成了本专利技术。
[0017]在本专利技术中，鉴定功能未知的蛋白的氨基酸序列和编码该蛋白的基因的核苷酸序列，该蛋白被认为是能够对多种糖基供体经转糖基作用催化L
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AA生成AA
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2G的α
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糖苷酶。因此，本专利技术的一个方面涉及该基因和该蛋白在生产AA
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2G中的用途以及该蛋白作为α
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糖苷酶的用途。
[0018]本专利技术所获得的α
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糖苷酶的最适反应温度范围为30℃
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45℃，最适pH条件为pH 5.5或pH 8.0，比酶活力最高可达8.3 U/mg。该酶在酸性或碱性条件下均能保持较高的活性，pH耐受范围广。
[0019]一种实施方式提供了一种蛋白，该蛋白包含SEQ NO.1所示的氨基酸序列，或基本由该氨基酸序列组成。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本专利技术的α
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葡萄糖苷酶还包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No.1所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如通过在末端添加标签序列，如His
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于枸杞的α
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葡萄糖苷酶，其特征在于，所述α
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葡萄糖苷酶包含SEQ No.1所示的氨基酸序列。2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述α
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葡萄糖苷酶。3.一种重组载体，其携带权利要求2所述的多核苷酸。4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体或含有权利要求2所述多核苷酸序列，可表达得到权利要求1所述的α
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葡萄糖苷酶。5.一种生产α
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葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，采用权利要求4所述重组细胞发酵产酶。6.一种用于生产2
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O
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α
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D
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葡萄糖基
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L
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抗坏血酸的方法，其特征在于，以麦芽糖作为糖基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，贾红华，齐雪莲，邵俊澜，余杰，严明，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：