一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明专利技术对人透明质酸酶PH20进行氨基酸定点突变，构建低糖基化修饰且催化活性提高的透明质酸酶突变体；本发明专利技术选取了来源不同的四个物种，运用BIOXM进行四个物种透明质酸酶蛋白序列的比较，确定了11个影响透明质酸酶活性的重要氨基酸位点，根据这些位点在透明质酸酶二级结构预测上的分布位置，和这些位点氨基酸的性质，最终确定突变序列及活性分析，并获得N1

【技术实现步骤摘要】
一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体。

技术介绍

[0002]透明质酸是一种粘性多糖，它是由双糖单位重复连接组成的直链高分子多糖，其双糖单位是由N
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乙酰葡萄糖胺和D
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葡萄糖醛酸构成，以β
‑
1，3糖苷键连接，这两种单糖是按照1:1的摩尔比构成，双糖单位之间是以β
‑
1，4糖苷键相连，广泛存在于动物结缔组织的细胞外基质中。它是组织基质中具有限制水分和其它细胞外的物质扩散的成分，在进行药物治疗时，透明质酸会阻碍药物分子的扩散作用。透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用的酶的总称，它能降低透明质酸的活性和粘度，提高组织中液体渗透能力。目前HAase在临床上被广泛用作药物的一种渗透剂(扩散因子)，与药物共同作用，可促进药物吸收。
[0003]目前市场上透明质酸酶的获取主要是从牛、羊组织内提取，由酵母表达及CHO表达系统表达的重组人透明质酸酶这三种方法，从动物组织中提取的透明质酸酶纯度较低，免疫原性较高，酵母表达量较低，而CHO表达系统成本较高，目前缺少廉价的原核表达体系，主要原因是透明质酸酶需要进行N
‑
糖基化才能够具有活性，而糖基化过程只能在真核表达体系中完成，原核表达体系不能进行糖基化修饰过程。
[0004]透明质酸酶目前已经应用在多个领域，美国FDA已经批准透明质酸酶作为分散剂，可用于促进药物的扩散和吸收，现透明质酸酶已被用于麻醉辅助剂，常与麻醉药物合用，增强麻醉效果。透明质酸酶也用于注射液的快速吸收，除此以外，由于肿瘤细胞能同时分泌HA和HAase，并且随着肿瘤细胞转移而增强分泌，所以透明质酸酶也被用于肿瘤检测的理想标记物。透明质酸酶可以促进代谢进程，减轻血管破坏和细胞及组织水肿，增加侧循环等作用，所以透明质酸酶也可用于减轻缺血损伤，降低心肌梗死概率。由于现在市场上使用的HAase大多数从哺乳动物睾丸中提取的，来源有限，产量较低，并且成本较高，由于其糖基化的限制，缺少有效的原核表达体系，而且由于受到免疫原性和纯度的限制，在临床应用时就会发生过敏反应和快速清除反映，在临床应用受到极大限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术选用哺乳动物细胞293T细胞表达人透明质酸酶PH20并通过分析它的一级结构以及二级结构预测，选出对透明质酸酶活性影响较大的氨基酸位点，通过氨基酸定点突变技术，进行透明质酸酶突变体的构建，并通过PEI转染试剂，进行透明质酸酶突变体蛋白重组表达质粒瞬转入细胞，进行蛋白表达。最后在通过活性分析，对比透明质酸酶各突变体之间活性变化情况，最终获得不需要进行糖基化也有活性的透明质酸酶。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体，对人透明质酸酶PH20进行氨基酸定点突变，构建透明质酸酶突变体，突变顺序为：N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279T/V53I/V302I/T306S；其中所述透明质酸突变体糖基化数量减少，且保留催化活性。
[0008]优选的是，所述透明质酸酶突变体分别为：
[0009]N1：PH20
‑
N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V
[0010]N2：PH20
‑
N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279T
[0011]N3：PH20
‑
N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279T/V53I
[0012]N4：PH20
‑
N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279T/V53I/V302I/T306S
[0013]优选的是，所述N1
‑
N4的目标基因扩增引物如SEQ ID NO.5
‑
26所示。
[0014]本专利技术还提供所述的透明质酸酶突变体的应用，可用于制备治疗透明质酸酶底物累积的疾病或病症的药物组合物。
[0015]优选的是，所述药物组合物配制为用于口服，或静脉内(IV)、皮下、肌内、肿瘤内、真皮内、局部、透皮、经直肠或表皮下注射给药。
[0016]优选的是，所述药物组合物包含免疫球蛋白(IG)、重组蛋白、合成多肽、RNA、DNA或化学药物。
[0017]优选的是，所述药物组合物配制为皮下注射给药形式，所述药物组合物中透明质酸酶突变体的量足以使得该药物组合物在治疗上有效。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术选取了来源不同的四个物种，运用BIOXM进行四个物种透明质酸酶蛋白序列的比较，确定了11个影响透明质酸酶活性的重要氨基酸位点，根据这些位点在透明质酸酶二级结构预测上的分布位置，和这些位点氨基酸的性质，最终获得N1
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N4一共4个透明质质酸酶突变体。
[0020]本专利技术对透明质酸酶进行分子改造主要是运用氨基酸定点突变技术。首先通过PCR扩增人透明质酸酶序列，再根据所要突变的氨基酸位点设计引物，运用点突变技术依次构建各个透明质酸酶突变体。用双酶切PTT5质粒与目的基因进行同源重组连接，构建突变体蛋白重组表达载体，将构建好的重组表达载体质粒瞬转入293T细胞进行连续传代培养，将培养后的细胞收集起来，用PBS适当重悬，进行超声破碎后，将破碎上清通过His柱纯化，最终得到突变体蛋白。利用DNS法测突变体蛋白的活性变化情况。DNS在碱性溶液中被透明质酸酶降解HA产物中的还原糖还原为氨基化合物，沸水浴后可以发生显色反应，测A540处的吸光值可以测得酶促反应液中的还原糖当量，用此方法进行透明质酸酶活性测定。进而筛选出对透明质酸酶活性影响较大的氨基酸位点，最终获得不需要糖基化也有活性的人的透明质酸酶。
附图说明
[0021]图1为透明质酸酶分子改造技术路线图；
[0022]图2为透明质酸酶二级结构分析，A透明质酸酶糖基化位点分布，B四个物种二级结构比对，C四个物种进化树构建，D四个物种序列比对等同性分析；
[0023]图3为四个物种透明质酸酶序列比对结果；
[0024]图4为透明质酸酶同源建模二级结构预测；
[0025]图5为蛋白活性中心位点氨基酸(D111、E113、E249)C
α
原子轨迹变化情况图；
[0026]图6为各突变体活性口袋变化情况统计；
[0027]图7为突变体蛋白电荷变化情况；
[0028]图8为透明质酸酶及其突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体，其特征在于，对人透明质酸酶PH20进行氨基酸定点突变，构建透明质酸酶突变体，其中所述透明质酸突变体糖基化数量减少，且保留催化活性。2.根据权利要求1所述的透明质酸酶突变体，其特征在于，所述透明质酸酶突变体分别为：N1：PH20
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N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228VN2：PH20
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N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279TN3：PH20
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N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279T/V53IN4：PH20
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N47S/N131D/N200S/N219K/Q234L/I228V/T293L/K279T/V53I/V302I/T30...

【专利技术属性】
技术研发人员：张守涛，于双营，方惠敏，田庆南，郭亚楠，马强，
申请(专利权)人：河南赛培生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：