一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，采用亲和层析梯度法纯化，通过不同粒径的改性成分处理制得的改性琼脂糖凝胶CL

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺。

技术介绍

[0002]玻璃酸酶又名透明质酸酶，是从哺乳动物睾丸中提取的一种能水解玻璃黏多糖的酶，是一种白色或微黄色粉末，在水中易溶，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶。无臭。稳定性较好，42℃持续加热60min活力不损失，100℃持续加热5min活力可保留80%。在低浓度的水溶液中较易失活，一般可用明胶或阿拉伯胶保护防止失活。Fe2+、Cu2+离子对酶有可逆抑制作用。Pb2+、Hg2+、Ni 2+、等离子对酶活性没有明显影响。在氯化钠(0.15mol/L)或硫酸鱼精蛋白的存在下，硫酸软骨素B(皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素钠及高浓度玻璃酸对玻璃酸酶的抑制作用可被逆转。
[0003]玻璃酸是存在于人体组织间基质中的粘多糖，能限制细胞外液的扩散。玻璃酸酶作用于玻璃酸分子中的葡萄糖胺键，使之水解和解聚，降低体液的粘度，使细胞间液易流动扩散，故可使局部积贮的药液、渗出液或血液扩散，加速药物吸收，减轻局部组织张力和疼痛，并有利于水肿、炎性渗出物的吸收、消散。
[0004]然而，随着国家药品标准的进一步提高，玻璃酸酶的质量标准也更加的严格。中国药典2010版规定玻璃酸酶酸度在4.5
‑
7.5；干燥失重<5.0％；酪氨酸含量<0.1ug；玻璃酸酶效价≥300单位；细菌内毒素为每1单位玻璃酸酶中含内毒素的量应小于0.20EU。因此，如何开发获取高纯度医用级玻璃酸酶产品成了众多生物制品厂商的研究重点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的：提供一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺；本专利技术的另一目的：提供一种用于高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺中的PMB亲和层析柱；本专利技术的第三目的：提供一种用于高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺中的微孔滤膜；本专利技术通过如下技术方案实现：一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，具体为：（1）、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15
‑
25倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000
‑
4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，上清液备用。
[0006]（2）、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100
‑
300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50
‑
70℃水浴箱中，搅拌保温8
‑
12小时；转移至2
‑
8℃环境中冷却，得冷却液。
[0007]（3）、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15M NaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液。
[0008]（4）、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02M NaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC
‑
0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV（柱床）进行分段收集并测
定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液。
[0009]（5）、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。
[0010]（6）、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用
‑
45℃预冷3
‑
6h；干燥箱真空度≤30 Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度医用级玻璃酸酶。
[0011]所述PMB亲和层析柱的制备方法为，（1）、取改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B 0.5
‑
1.5L，用5
‑
15L、0.5M 的NaCl 溶液滤洗，再用10L 纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1
‑
2L，得悬浮液a；（2）、将悬浮液a 置于2
‑
6℃环境冰浴，边搅拌边滴加50
‑
150ml环氧氯丙烷滴加速度为15
‑
25ml/min、100
‑
300ml二甲亚砜滴加速度为20
‑
30ml/min，滴加完毕后静置反应4
‑
8h，产物用纯水滤洗3
‑
5次，用纯水悬浮至1
‑
2L，得悬浮液b；（3）、取多粘菌素B 8
‑
16g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素 B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，23
‑
27℃温度下搅拌10
‑
14h，静置2h，产物先用5
‑
15L、0.5M 的NaCl 溶液滤洗，再用10L 纯水洗涤3
‑
5次，按需求规格装柱，即得。
[0012]所述改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶 CL
‑
4B 80
‑
90份、改性成分3
‑
9份；（1）、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻10
‑
20min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为3
‑
7：2
‑
4：1；（2）、琼脂糖凝胶 CL
‑
4B以4
‑
8℃/min升温至65
‑
75℃，恒温2
‑
6min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，20
‑
60Mpa加压40
‑
60s成型，得改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B粗品；（3）、将改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B粗品置于5倍质量的溶剂中，300
‑
400rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环6
‑
10次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B。
[0013]所述改性成分为质量比为1：1
‑
3的 N
‑
(1,3
‑
二甲基丁基)
‑
N'
‑
苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物。
[0014]所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料55
‑
85份、有机溶剂60
‑
120份、致孔剂3
‑
9份、塑化剂0.5
‑
1.5份；（1）、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其特征在于：具体步骤如下，（1）、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15
‑
25倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000
‑
4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，备用；（2）、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100
‑
300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50
‑
70℃水浴箱中，搅拌保温8
‑
12小时；转移至2
‑
8℃环境中冷却，得冷却液；（3）、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15M NaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液；（4）、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02M NaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC
‑
0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV（柱床）进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液；（5）、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液；（6）、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用
‑
45℃预冷3
‑
6h；干燥箱真空度≤30 Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度医用级玻璃酸酶。2.如权利要求1所述的一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其特征在于：所述PMB亲和层析柱的制备方法为，（1）、取改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B 0.5
‑
1.5L，用5
‑
15L、0.5M 的NaCl 溶液滤洗，再用10L 纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1
‑
2L，得悬浮液a；（2）、将悬浮液a 置于2
‑
6℃环境冰浴，边搅拌边滴加50
‑
150ml环氧氯丙烷滴加速度为15
‑
25ml/min、100
‑
300ml二甲亚砜滴加速度为20
‑
30ml/min，滴加完毕后静置反应4
‑
8h，产物用纯水滤洗3
‑
5次，用纯水悬浮至1
‑
2L，得悬浮液b；（3）、取多粘菌素B 8
‑
16g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素 B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，23
‑
27℃温度下搅拌10
‑
14h，静置2h，产物先用5
‑
15L、0.5M 的NaCl 溶液滤洗，再用10L 纯水洗涤3
‑
5次，按需求规格装柱，即得。3. 如权利要求2所述的一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其特征在于：所述改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶 CL
‑
4B 80
‑
90份、改性成分3
‑
9份；（1）、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻10
‑
20min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为3
‑
7：2
‑
4：1；（2）、琼脂糖凝胶 CL
‑
4B以4
‑
8℃/min升温至65
‑
75℃，恒温2
‑
6min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，20
‑
60Mpa加压40
‑
60s成型，得改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B粗品；（3）、将改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B粗品置于5倍质量的溶剂中，300
‑
400rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环6
‑
10次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶 CL
‑
4B。4. 如权利要求3所述的一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其特征在于：所述改性成分为质量比为1：1
‑
3的 N
‑
(1,3
‑
二甲基丁基)
‑
N'
‑
苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；所述溶剂为质量比为1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一四页，
申请(专利权)人：南昌市万华生化制品有限公司，
类型：发明
国别省市：